七鳃鳗Bam32cDNA分析、抗体制备和免疫表达分析

为探索七鳃鳗(Lampetra japonica)与32 kDB淋巴细胞接头分子(B-cell adaptor molecule of 32 kDa,Bam32)同源的分子Lja-Bam32基因在其免疫应答反应中的作用,利用嵌套PCR方法成功克隆了Lja-Bam32基因开放阅读框的cDNA序列,包含747 bp核苷酸,编码含有249个氨基酸残基的蛋白质。通过多序列比对发现,Lja-Bam32具有该家族两个特征结构域Src同源区2和Pleckstrin同源结构域和两个保守的酪氨酸磷酸化位点。系统发育分析显示,Lja-Bam32与不同物种的Bam32分子位于同一个聚类群,以上结果表明,无颌类七鳃鳗中存在Bam32家族分子。然后通过构建表达载体对Lja-Bam32进行了原核表达,并利用纯化后的重组蛋白成功制备了兔抗Lja-Bam32的多克隆抗体。利用实时荧光定量PCR方法以及免疫印迹方法分别检测了日本七鳃鳗免疫相关组织中Lja-Bam32基因的mRNA及蛋白在混合菌免疫刺激前后的差异表达情况。结果表明,与未免疫组相比,经过混合菌[念珠菌(Candida albicaus)、大肠杆菌(Escherichia coli)和金黄葡萄珠菌(Staphylococcus cutetvs)]免疫刺激后,Lja-Bam32的mRNA转录表达量在外周血淋巴细胞、鳃囊和髓样小体中显著上调;而该基因的蛋白水平表达量只在淋巴细胞和髓样小体中显著上调,在其他组织中没有明显的变化。由于VLRB+淋巴细胞主要在外周血淋巴细胞和髓样小体组织中分布,推测Lja-Bam32应该与七鳃鳗类B细胞(VLRB+淋巴细胞)的免疫应答反应有关。研究结果为深入研究日本七鳃鳗VLRB+淋巴细胞适应性免疫应答的信号转导分子机制提供了参考。

B淋巴细胞信号转导相关接头蛋白Bam32与Hic-5的相互作用

32kDB淋巴细胞接头分子(Bam32)是调控B细胞抗原受体(Bcellantigenreceptor,BCR)信号转导通路的关键蛋白质分子之一.为了研究Bam32的功能及其作用机理,应用酵母双杂交技术筛选了能与Bam32相互作用的蛋白质分子.筛选发现1个呈强阳性反应的克隆,其基因编码Hic5,为paxillin蛋白家族成员之一.Paxillin是整合素(integrin)信号转导通路中的关键蛋白质分子,而整合素在细胞对细胞外基质分子的粘附、细胞运动等方面起了重要的作用,因此对Bam32与Hic5的相互作用进行了进一步研究.用293T细胞共转染和特异性免疫共沉淀法证实,Bam32可在哺乳动物细胞中与Hic5共沉淀,证明它们可以在细胞内相互作用.应用免疫共沉淀法和抗磷酸化酪氨酸抗体检测显示,激酶Lyn可导致Bam32和Hic5的磷酸化.这些研究结果提示,Bam32与Hic5的相互作用可能在激活下游分子的信号转导级联反应以及调节细胞的粘附和运动等功能中发挥了重要的作用.

与接头蛋白Bam32相互作用的蛋白分子的鉴定

目的:研究接头蛋白(adaptorprotein)Bam32在B细胞抗原受体(Bcellantigenreceptor,BCR)信号转导级联反应中的作用。方法:以Bam32全序列为诱饵,应用酵母双杂交技术筛选能与Bam32相互作用的蛋白分子,并用293T细胞共转染和免疫共沉淀法加以证实。结果:应用酵母双杂交技术筛选出能与Bam32相互作用的蛋白分子,其中1个出现强阳性反应的克隆编码酪氨酸激酶Lyn。用293T细胞共转染和特异性免疫共沉淀法证实,Bam32可在哺乳动物细胞中与Lyn共沉淀。应用抗磷酸化酪氨酸抗体检测显示,Bam32与Lyn相互作用可导致Bam32磷酸化。结论:Bam32可同Lyn相互作用,导致Bam32磷酸化,这在激活下游产物的级联反应中可能起重要作用。