伪狂犬病病毒BarthaK61株Us区缺失片段的鉴定

为利用PCR技术对伪狂犬病病毒（PRV）BarthaK61株us区的具体缺失情况进行分析，根据已发表的PRV全基因组序列设计了4对引物，以PRV双城株基因组作为对照，对us区进行扩增。对扩增片段的序列分析表明，BarthaK61株基因组的Us区缺失了3489bp，为第122560～126049位核苷酸，其间包括部分gI基因、全部的gE和Us9基因以及部分Us2基因。

表达绿色荧光蛋白的伪狂犬病毒Bartha-K61株TK^-突变株的构建

提取伪狂犬病毒(PRV)Bartha-K61株基因组DNA为PCR扩增模板,并根据GenBank已发表的PRVKa plan株UL区UL25、UL24、UL23、UL22基因序列,选择保守序列设计了两对引物,分别扩增出位于UL23(TK)两侧(含部分TK基因)的可用于同源重组的左臂片段(L)和右臂片段(R),L包括部分UL25、全部UL24、部分TK,R包括部分TK及部分UL22,L和R的拼接片段中TK基因内部缺失270个核苷酸。将L片段和R片段克隆于pBluescriptM13-载体上,获得pSKLR;再将绿色荧光蛋白载体pEGFP-C1上含GFP及其多克隆位点的完整的基因表达盒插入pSKLR的L片段和R片段之间构成转移载体pSKLRG。提取pSKLRG质粒,经单酶切线性化后用脂质体与PRVBartha-K61株共转染143TK-细胞,在细胞培养液中有5 溴脱氧尿嘧啶(BrdU)存在的条件下筛选出表达绿色荧光蛋白的重组PRVBartha-K61毒株:PRVrBGFP。

高剂量高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒TJM-F92疫苗株对低剂量伪狂犬病毒Bartha-K61疫苗株的免疫干扰研究

为研究高剂量高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)TJM-F92疫苗株对低剂量伪狂犬病毒(PRV)Bartha-K61疫苗株是否存在免疫干扰作用,本研究对其从体液免疫水平、免疫攻毒保护水平及病理学变化等方面进行评价。结果表明,二联免疫组抗体消长规律与低剂量PRV Bartha-K61株免疫对照组抗体消长规律相一致,二联免疫组中高剂量PRRSV TJM-F92株未抑制低剂量PRV Bartha-K61株抗体生成;二联免疫组与低剂量PRV Bartha-K61免疫对照组对PRV JL1株强毒攻击保护率均为5/5;免疫病理学研究结果表明,两组免疫组攻击PRV JL1株强毒后各组织器官病理变化轻微;二联免疫组与低剂量PRV Bartha-K61免疫对照组均可对PRV强毒攻击产生良好的保护效果。综上,高剂量PRRSV TJM-F92株对低剂量PRV Bartha-K61株无免疫干扰作用。

Bartha K61株活疫苗对猪伪狂犬变异毒株和传统毒株的免疫保护效力分析

为了分析猪伪狂犬病活疫苗Bartha K61株预防流行变异毒株的效力。以经典PRV-EA株和变异PRV-XT株为攻毒毒株,评价Bartha K61活疫苗免疫仔猪对伪狂犬病病毒变异株的保护效力。用Bartha K61株活疫苗免疫4~5周龄断奶仔猪,免疫28 d后,分别用PRV-EA株和流行变异PRV-XT株攻毒,观察仔猪的临床症状和病理变化,检测鼻腔排毒情况。结果显示,Bartha K61株活疫苗可对经典PRV-EA株攻毒提供良好的免疫保护,但对变异毒株PRV-XT仅能提供部分保护。PRV-EA株攻毒组所有猪只未出现明显临床症状,而PRV-XT攻毒组出现较为明显的临床症状。表明Bartha K61株活疫苗对传统毒株有良好保护效果,而对流行变异毒株不能提供完全保护。

Bartha-K61疫苗对PRV变异株免疫效果的Meta分析

为了给预防与控制伪狂犬病(PR)提供科学参考,本试验采用Meta分析的方法对已发表的Bartha-K61疫苗对伪狂犬病病毒(PRV)变异株免疫效果进行评估。首先通过计算机建立检索式检索中国知网、万方、维普和PubMed数据库,收集对照试验;然后采用RevMan 5.4.1软件以攻毒保护率为结局指标进行Meta分析;共纳入15篇文献,190头仔猪,试验组105头,对照组85头,试验组均采用接种Bartha-K61疫苗+攻毒PRV变异株的干预方式,对照组有3种干预方式,分别为接种Bartha-K61疫苗+攻毒PRV经典株、不接种PRV疫苗+攻毒PRV变异株、接种其他PRV疫苗+攻毒PRV变异株,其中只有不接种PRV疫苗+攻毒PRV变异株对照组的数据有统计学意义。结果显示:各研究间同质(P=0.91>0.1,I~2=0<50%),研究结果稳定性较好,Bartha-K61疫苗对PRV变异株的攻击可以提供免疫保护(合并OR=22.77,95%CI=9.91~52.28)。综合分析15篇单个试验研究的结果表明,经典疫苗Bartha-K61对PRV变异株的免疫保护达到80%以上,且高滴度的疫苗效果更好,但比起其对经典株的保护效果略差;而且,以PRV变异株为亲本研制的疫苗对亲本毒株的攻毒保护效果优于Bartha-K61疫苗。

猪伪狂犬病毒Bartha-K61疫苗株和变异株主要免疫原性基因分析

自2011年底以来,我国多个省份暴发了猪伪狂犬病,一些研究院所证实当前猪伪狂犬病毒流行株发生了一定程度的变异,疫苗不能提供完全的保护。为了在分子生物学水平上比较不同厂家猪伪狂犬病毒Bartha-K61疫苗株,以及与当前流行的猪伪狂犬病病毒变异株,在主要免疫原性蛋白之间的差异,选取了4个厂家的活疫苗Bartha-K61株,通过二代测序方法进行测序,对Bartha-K61株gB、gC和gD这3种主要免疫原性基因以及推导出的氨基酸序列与变异株之间进行同源性分析。结果显示,Bartha-K61疫苗株与变异株gB蛋白序列中有23处特征性的差异,同源性为96.3%~96.9%;gC蛋白序列中有25处特征性的差异,同源性为92.7%~93.1%;gD蛋白序列中有10处特征性的差异,同源性为96.8%~97.3%;以gB、gC和gD氨基酸序列建立的进化分析结果显示,Bartha-K61疫苗株与变异株分属两个不同进化分支。

猪伪狂犬病活疫苗(Bartha-K61株,传代细胞源)的免疫程序研究

研制了三批猪伪狂犬病活疫苗(Bartha-K61株,传代细胞源),采用对3~4周龄仔猪首免、一个月后加强免疫1次,妊娠母猪于分娩前3~4周进行一次免疫的免疫程序进行疫苗接种,并在免疫前和免疫后定期采血检测PRV抗体。结果表明:免疫前PRV母源抗体为阴性的仔猪在首免后7日PRV抗体检测为阳性,21日达到高峰,并在首免后130日PRV抗体仍维持在一个较高水平;免疫前PRV母源抗体检测为阳性的仔猪,在首免后3日和7日时PRV抗体略有下降,但随后上升并在首免后21日达到高峰,直至首免后130日仍为PRV抗体阳性;免疫前PRV抗体为阴性的妊娠母猪,在免疫后3日和7日PRV抗体有一定上升,免疫后14日达到较为理想水平,并于分娩前达到高峰,产仔数也较为理想;免疫前PRV抗体为阳性的妊娠母猪,在免疫后3日和7日PRV抗体水平稍有下降,但随后上升,并在分娩前达到高峰,产仔数也较为理想。综上结果表明,此免疫程序较为适合仔猪和妊娠母猪的免疫。

带BAC质粒的重组伪狂犬病毒的构建及其体外生长特性研究

本研究通过基因克隆技术以伪狂犬病病毒(PRV)弱毒疫苗株Bartha K61株的部分TK基因作为同源重组序列,以绿色荧光蛋白基因(EGFP)作为筛选标记,构建了带LoxP位点的pUCTKAB-EGFP质粒,将pBeloBACII线性化后插入到pUCTKAB-EGFP中构建了转移载体pUCTK-EGFP-BACII。将PRV基因组和转移载体共转染Vero细胞,利用同源重组在Bartha K61株的TK基因中插入了BAC质粒和绿色荧光蛋白筛选标记,经过11轮噬斑纯化和鉴定证实获得了带BAC质粒的重组伪狂犬病毒rv-PRVBAC。通过噬斑试验和一步生长曲线测定等方法对重组伪狂犬病毒rv-PRVBAC的生长特性进行研究,结果发现带有BAC质粒及筛选标记的重组病毒rv-PRVBAC在体外细胞培养中的增殖速度与亲本毒Bartha K61株相比没有明显差别,说明大的基因片段的插入没有影响重组病毒在体外的繁殖速度。重组病毒rv-PRVBAC在Vero细胞上盲传18代,其绿色荧光蛋白仍能够稳定表达,通过PCR鉴定可以检测到插入的外源片段和插入位点两侧的病毒基因序列,表明所获得的重组病毒rv-PRVBAC得到了稳定遗传。本研究成功获得了带BAC质粒的重组伪狂犬病毒rv-PRVBAC,为进一步开展PRV的细菌人工染色体的构建奠定了基础。

猪伪狂犬病活疫苗(Bartha K61株)对变异株的保护效力

本研究旨在检测仔猪免疫猪伪狂犬病活疫苗（Bartha K61株）后,抵抗伪狂犬病病毒（PRV）变异株攻击的保护效果。取4～6周龄PRV抗体阴性仔猪,接种猪伪狂犬病活疫苗,1周后用PRV变异株（AH02LA株）攻毒,检测攻毒后临床症状、直肠温度、鼻腔排毒和肺部病变。疫苗免疫组在免疫后7 d均可以检测到gB抗体。攻毒对照组攻毒后出现典型伪狂犬症状,发病率为100%,死亡率为60%,所有猪只鼻拭子均检出排毒,所有猪只肺部均有出血、淤血等病变。免疫组的猪只攻毒后,所有猪只均未出现明显临床症状,部分猪只鼻拭子检出排毒,排毒持续时间缩短,排毒量显著减少,所有免疫猪只肺部未见明显病变。结果表明：伪狂犬病活疫苗免疫猪后对PRV变异株的攻击具有良好的保护效果。

免疫增强剂对猪伪狂犬灭活疫苗的免疫增强作用

为了评价免疫增强剂VA5对猪伪狂犬病毒灭活疫苗的免疫增强作用,将VA5与灭活疫苗混合并制成疫苗。通过常规Bartha-K61株灭活疫苗、含免疫增强剂灭活疫苗和Bartha-K61活疫苗3组免疫效力对比试验,首次免疫后14和35 d对猪进行采血,并且进行中和实验以及对相关细胞因子进行检测。结果表明,该免疫增强剂能够显著地提高猪伪狂犬灭活疫苗血清中抗体产生,同时能显著提高猪外周血淋巴细胞(PBMC)中IL-2和IFN-γ mRNA表达。交叉中和试验表明,VA5能够显著地提高猪伪狂犬灭活疫苗对伪狂犬流行变异株的中和作用。试验表明,VA5能够显著提升猪伪狂犬病毒灭活疫苗体液与细胞免疫,为研制免疫效果更好的灭活疫苗提供了依据。

伪狂犬病病毒(PRV)不同毒株抗原相关性研究

为了解PRV不同毒株之间的抗原性差异,评价弱毒FB株预防新型PRV的潜力,以4株PRV(FA、FB、Bartha-K61和FJ2012)毒株及其高免血清为材料,应用交叉中和试验测定PRV不同毒株的抗原性差异,通过FB免疫猪攻毒试验评价弱毒FB株对新型PRV的保护潜力。结果表明:中和抗体测定表明兔抗FB株、FA株、Bartha-K61株和FJ2012株高免血清的中和效价分别为1∶54、1∶91、1∶91和1∶215。交叉中和试验显示FB株与FA株、FB株与FJ2012株、FA株与FJ2012株的抗原相关性(R值)均大于0.8,Bartha-K61株与FA株、FB株、FJ2012株的R值均小于0.4,表明FB株与FJ2012株的抗原相关性高于Bartha-K61株与FJ2012株。仔猪免疫攻毒试验显示FB免疫猪能抵抗新型PRV(FJ2012株)的攻毒,保护率100%。提示PRV弱毒FB株有望成为预防新型猪伪狂犬病毒(FJ2012株)的疫苗候选株。

基于US区缺失位点猪伪狂犬病病毒疫苗株与野毒株鉴别诊断方法的建立

依据GenBank中公布的猪伪狂犬病病毒全基因组序列,针对gI、gE、28K、TK四个基因序列,设计、合成了5条引物,并对野毒株SA株、gI-/gE-/PRVSA双基因缺失株和Bartha K61疫苗株进行了扩增,得到2061bp、1323bp、801bp和963bp特异性目的条带,其中BarthaK61疫苗株基因组检测最小浓度为136pg/μL。建立了针对野毒株和两种疫苗株的鉴别诊断方法。