自噬相关基因PTEN和Beclinl在乳头状甲状腺癌中的表达和意义

目的检测自噬相关基因PTEN和Beclinl在乳头状甲状腺癌中的蛋白表达,并探讨其与乳头状甲状腺癌发生、发展的相关性及意义。方法应用免疫组化染色法检测78例乳头状甲状腺癌和45例癌旁正常黏膜组织(距离癌组织>2cm)标本自噬相关基因PTEN和Beclinl的蛋白表达,并结合临床病理因素进行分析。结果乳头状甲状腺癌组织中PTEN和Beclinl的阳性表达率分别为41.0%和43.6%,显著低于正常组织的77.8%和73.3%(P<0.05);PTEN与乳头状甲状腺癌的包膜侵犯程度、淋巴结转移、性别、年龄无关(P>0.05);Beclinl与乳头状甲状腺癌的淋巴结转移有关(P<0.05),与包膜侵犯程度、性别、年龄无关(P>0.05)。PTEN与Beclinl在乳头状甲状腺癌中的表达呈正相关(r=0.532)。结论自噬相关基因PTEN和Beclinl在乳头状甲状腺癌组织中蛋白表达下调,并与肿瘤淋巴结转移有关。自噬活性的改变可能与乳头状甲状腺癌的发生、发展相关。

Beclin1基因在消化道肿瘤发生发展中的作用及其影响因素研究进展

自噬是一种高度保守的溶酶体降解的过程,其能降解细胞中受损的细胞器和错误折叠蛋白,以维持细胞内环境稳定,自噬对肿瘤具有双重作用,其既能为肿瘤细胞提供营养和保护,又可抑制或杀伤肿瘤细胞,而Beclin1是重要的自噬相关基因,其在肿瘤的发生发展中可调节自噬状态,其表达改变可影响肿瘤发生发展,并与化疗耐药相关。了解Beclin1的结构、作用机制、影响因素以及与消化道肿瘤的关系,将会为消化道肿瘤的检测、诊断、治疗、预后提供新策略。

自噬相关基因Beclin1在外阴鳞癌中的表达及临床意义

目的:探讨自噬相关基因Beclin1在外阴鳞癌中的表达及其与临床病理特征的关系。方法:采用免疫组织化学的方法检测Beclin1蛋白在50例外阴鳞癌、30例外阴上皮内瘤变及10例正常外阴组织中的表达情况,RT-PCR的方法检测25例外阴鳞癌、13例外阴上皮内瘤变及10例正常外阴组织中Beclin1 mRNA的表达情况。结果:Beclin1蛋白在外阴癌、外阴上皮内瘤变、正常外阴组织中阳性率分别为52.0%、8 6.6%、9 0.0%,Beclin1蛋白在外阴癌组织中的表达明显低于外阴上皮内瘤变及正常外阴组织,具有统计学差异(P<0.05)。Beclin1 mRNA在外阴癌中的相对表达量为(0.318±0.031),显著低于外阴上皮内瘤变(0.634±0.037)及正常外阴组织(0.702±0.042)。Beclin1蛋白在外阴鳞癌中的表达与肿瘤临床分期、分化程度、有无淋巴结转移有关(P<0.05),与患者年龄无关(P>0.05)。结论:Beclin1在外阴鳞癌组织中表达下调,提示自噬活性的改变可能对外阴鳞癌的发生、发展起一定的作用。

自噬相关基因在肾透明细胞癌中的表达及其临床意义

目的本研究通过对肾透明细胞癌自噬相关基因蛋白水平的检测,分析其与临床病理资料的关系。方法 Western blot检测肾透明细胞癌中自噬相关基因LC3和Beclin1的蛋白表达量。结果 Western blot检测显示肾透明细胞癌中自噬相关基因LC3和Beclin1的蛋白表达水平均低于癌旁组织组(P<0.05);低分化组和中分化组LC3的蛋白表达水平比高分化组低(P<0.05);进展期和转移性肾癌组比局限性肾癌组LC3的蛋白表达水平低(P<0.05)。结论自噬在肾透明细胞癌中的低表达水平可能与肾透明细胞癌的发生、发展及转移有关。

烟草叶片愈伤组织形成过程中的细胞程序性死亡(英文)

以烟草叶片在MS培养基上诱导的10个不同时期的愈伤组织为材料,通过荧光染色显微观察到细胞核在形态上发生了缩缢变形,DNA Ladder检测也出现了标志细胞程序性死亡特征的DNA片断,表明了愈伤组织形成过程中发生了细胞程序性死亡(programmed cell death,PCD),而在诱导的第六个时期(13 d)DNA的脱尾现象最为明显,表明这一时期是PCD发生较为活跃的时期。利用RT-PCR法在诱导的前九个时期,即诱导的第3、5、7、9、11、13、15、17、19 d的叶片的愈伤组织中均扩增出了细胞程序性死亡相关Beclin1基因的cDNA片段(678 bp),Northen杂交结果显示,在诱导的第13 d,类Beclin1基因表达较强。通过酶联免疫法测定诱导前14 d叶片中内源激素ABA的含量变化,在诱导的第六时期ABA含量相对达到了峰值,结果表明:在烟草叶片愈伤组织诱导过程中伴随PCD的发生,在此过程中内源激素ABA与Beclin1基因起到了调节作用。

自噬基因Beclin1和微管相关蛋白轻链3与胃癌的关系研究

目的研究胃部非癌组织、胃部癌旁组织与胃部癌组织中自噬基因Beclin1和微管相关蛋白轻链3(microtubule-associated protein 1 light chain 3,MAPLC3)基因的表达含量,确定Beclin1和MAPLC3表达含量与胃癌之间的联系。方法使用实时逆转录-聚合酶链反应(Real-Time reverse transcription polymerase chain reaction,Real-Time RTPCR)检测胃部非癌组织、胃部癌旁组织与胃部癌组织中Beclin1以及MAPLC3基因的mRNA表达含量。使用蛋白质印迹法(Western blot)方法检测胃部非癌组织、胃部癌旁组织与胃部癌组织中Beclin1以及MAPLC3基因的蛋白表达含量。结果与胃部非癌组织相比,胃部癌旁组织Beclin1以及MAPLC3的mRNA含量显著降低(P<0.01),胃部癌组织中Beclin1以及MAPLC3的mRNA含量也显著降低(P<0.01);与胃部癌旁组织相比,胃部癌组织中Beclin1以及MAPLC3的mRNA含量也显著降低(P<0.05)。与胃部非癌组织相比,胃部癌旁组织Beclin1以及MAPLC3的蛋白含量显著降低(P<0.05),胃部癌组织中Beclin1以及MAPLC3的蛋白含量也显著降低(P<0.01);与胃部癌旁组织相比,胃部癌组织中Beclin1以及MAPLC3的蛋白含量也显著降低(P<0.05)。结论自噬相关基因Beclin1以及MAPLC3的mRNA和蛋白水平在胃癌组织中表达降低,这提示自噬相关基因与胃癌的发生、发展密切相关。

自噬基因Beclinl对宫颈癌HeLa细胞生长影响的体内外研究

目的研究自噬基因Beclinl在宫颈癌细胞株HeLa中过表达对HeLa细胞体内外生长的影响。方法构建自噬基因Beclinl的真核表达载体pcDNA3．1（＋）-Beclinl，转染HeLa细胞[pcDNA3．1（＋）．Beclinl组]，同时设空载体转染组[pcDNA3．1（＋）组]和空白对照组。采用荧光定量PCR和Westernblot法检测3组HeLa细胞中BeclinlmRNA和蛋白的表达变化，采用四甲基偶氮唑蓝（MTF）法检测3组HeLa细胞生长的变化，采用流式细胞术检测3组HeLa细胞的凋亡情况，采用单丹磺酰尸胺染色检测3组HeLa细胞的自噬情况。将3组HeLa细胞分别接种于裸鼠皮下，观察体内成瘤性和生长情况。结果pcDNA3．1（＋）-Beclinl组、pcDNA3．1（＋）组和空白对照组HeLa细胞中BeclinlmRNA的表达水平分别为994．718±468．764、0．570±0．121和0．736±0．251。pcDNA3．1（＋）-Beclinl组HeLa细胞中BeclinlmRNA的表达水平较pcDNA3．1（＋）组和空白对照组明显增高（P〈0．05），而pcDNA3．1（＋）组与空白对照组间的差异无统计学意义（P〉0．05）；3组HeLa细胞中Beclinl蛋白的表达情况与mRNA相似。pcDNA3．1（＋）-Beclinl组的自噬细胞率为10．9％，明显高于空白对照组和pcDNA3．I（＋）组（分别为2．5％和3．1％，P〈0．05）。pcDNA3．1（＋）-Beclinl组HeLa细胞的凋亡率为（28．2±2．3）％，明显高于peDNA3．1（＋）组和空白对照组[分别为（14．6±4．6）％和（11．2±3．0）％，P〈0．05]。Beclinl在HeLa细胞中过表达可抑制肿瘤细胞在体外的生长，抑制率为58．7％；并可使HeLa细胞在裸鼠体内成瘤时间延长，瘤体体积和重量明显小于pcDNA3．1（＋）组和HeLa组（P〈0．05），抑瘤率为52．2％。结论自噬基因Beclinl过表达可抑制HeLa细胞在体内外的增殖，促进细胞的自噬与凋亡，为宫颈癌基因治疗提供了新的选择途径。

吉西他滨对Beclinl基因沉默的人胰腺癌MiaPaCa-2细胞的周期及凋亡的影响

目的 探讨吉西他滨对Beclinl基因沉默的人胰腺癌MiaPaCa-2细胞周期及凋亡的影响.方法 构建靶向Beclinl的siRNA,插入表达质粒,转染MiaPaCa-2细胞.采用RT-PCR法和蛋白质印迹法检测细胞Beclinl mRNA及蛋白的表达,应用吉西他滨处理Beclinl基因沉默的MiaPaCa-2细胞,应用流式细胞仪检测细胞周期及细胞凋亡状况.结果 成功获得Beclin1基因沉默的MiaPaCa-2细胞,转染后细胞的Beclin1 mRNA表达量从对照组的1.0下降到0.295;S、G2期细胞数减少,而G1期细胞增多;细胞凋亡未受影响.应用吉西他滨处理后,Beclin1基因沉默的MiaPaCa-2细胞的S期细胞数进一步减少,而G1、G2期细胞增多,细胞凋亡被抑制.结论 Beclinl表达沉默使人胰腺癌细胞系MiaPaCa-2细胞周期发生改变,并影响吉西他滨对细胞周期及凋亡的作用.

Beclin1基因siRNA慢病毒载体构建和鉴定

本研究通过慢病毒载体(pRNAT-U6.2/Lenti)构建靶向Beclin1基因的RNA干扰(RNAi)重组体,用以建立Beclin1基因稳定沉默的非小细胞肺癌(NSCLC)A549细胞株。PCR鉴定结果显示3个扩增的阳性片段均已插入pRNAT-U6.2/Lenti载体;测序结果证明3个重组慢病毒载体pRNAT-U6.2/Lenti-si356、pRNAT-U6.2/Lenti-si423和pRNAT-U6.2/Lenti-si684的插入序列完全正确;重组慢病毒载体感染A549细胞后,RT-PCR和Westernblot检测结果均证实3组重组体感染的细胞内Beclin1mRNA和蛋白表达都受到不同程度的抑制,Beclin1mRNA的沉默效率分别为35.56%、89.22%和66.78%。结果显示成功构建了Beclin1基因的RNAi病毒重组载体,并建立了其稳定表达的NSCLC A549细胞株,为探讨Beclin1基因对NSCLCA549细胞生物学行为的影响提供了新的细胞模型。

辐射诱导人骨髓间充质干细胞自噬反应的研究

目的观察辐射条件下人骨髓间充质干细胞（hBMMSC）的自噬反应。方法应用An—nexin—V／PI双标法检测0、2、4、8、10GyX线照射后4hhBMMSC凋亡率和坏死率的变化；通过透射电子显微镜观察0、8、10Gyx线照射后4h的hBMMSC自噬形态学变化，以经典的自噬诱导剂雷帕霉素处理组作为阳性对照，并应用RT—PCR技术检测自噬相关基因Beclinl和微管相关蛋白1轻链3（micro- tubule-associated protein 1 light chain 3 ,MAPLC3，MAPLC3，简称为LC3）mRNA表达。结果在低于8Gy的剂量范围内，hBMMSC的凋亡率随照射剂量的增加而降低，坏死率和死亡（凋亡＋坏死）率随照射剂量的增加而升高，但升高幅度较小。当剂量增至10Gy时，凋亡率升至最高，而坏死率和死亡率的升高幅度增大。并且整体凋亡率变化比坏死率明显。透射电镜观察显示正常对照组中偶见自噬泡（自噬体和自噬溶酶体合称为自噬泡）出现，而照射组及阳性对照组中均可见明显自噬泡聚集，8Gy照射组的自噬泡阳性细胞比例为（71．67±7．64）％，高于10Gy照射组的（56．67±7．64）％。RT—PCR检测结果显示正常对照组中Beclinl mRNA和LC3mRNA表达水平均很低，而照射组及阳性对照组中两个基因的表达明显升高，且8Gy照射组（0．518±0．005、0．408±0．006）表达水平高于10G照射组（0．441±0．002、0．360±0．019）％。结论辐射应激可以诱导hBMMSC的自噬反应，在一定照射剂量范围内，自噬可能对hBMMSC有放射保护作用。

Beclin1和NF-κBp65表达与肝癌发生发展的相关性研究

目的:分析自噬基因Beclin1和核因子NF-κBp65在原发性肝细胞性肝癌(pri ma-ry human hepatocellular carcinoma,HCC)中的表达及探讨两者之间的关系。方法:分别应用免疫组化SP法和原位杂交的方法检测HCC50例、肝硬化30例、肝炎30例、正常肝组织10例中Beclin1和NF-κBp65蛋白及mRNA的表达。结果:Beclin1蛋白在HCC中的表达高于在肝硬化、肝炎和正常肝组织中的表达(χ2值分别为20.39、5.31和14.42,P<0.05),Beclin1蛋白在肝炎组织中的表达明显高于在肝硬化和正常肝组织中的表达,χ2值分别为4.44、4.12,P<0.05。Beclin1 mRNA在HCC中的表达高于在肝硬化和正常肝组织中的表达,χ2值分别为14.97、9.27,P<0.05。在肝炎组织中的表达高于在肝硬化和正常肝组织中的表达,χ2值分别为8.30、5.65,P<0.05。NF-κBp65蛋白在HCC中的表达高于在肝硬化、肝炎和正常肝组织中的表达(χ2值分别为10.89、13.93和8.44,P<0.05),NF-κBp65 mRNA在HCC中的表达高于在肝硬化、肝炎和正常肝组织中的表达,χ2值分别为15.76、31.54和14.42,P<0.05。两者在肝癌组织中的表达呈正相关。结论:Beclin1和NF-κBp65异常表达与HCC的发展密切相关,在HCC的发展过程中可能起重要的作用。

稳定沉默Beclin1基因的胰腺腺泡细胞株AR42J的建立

目的采用RNA干扰技术沉默大鼠胰腺腺泡细胞AR42J的Beclinl基因表达，构建稳定的Beclinl基因沉默的AR42J细胞系。方法设计并合成3种靶向大鼠BeclinlmRNA的shRNA及阴性对照shRNA，分别插入质粒GVl12，重组质粒分别命名为p—sh．Beclin1-1、P—sh．Beclinl-2、P—sh—Beclinl-3及p—shRNA—NC。应用1ip03000将重组质粒瞬转人AR42J细胞，应用RT—PCR检测细胞Beclin1mRNA表达，筛选出沉默效率最高的质粒，在293T细胞内经慢病毒包装（LV—shBeclinl），感染AR42J细胞，应用嘌呤霉素筛选，采用RT．PCR及蛋白质印迹法分别检测病毒感染细胞BeclinlmRNA和蛋白表达。结果重组质粒经琼脂糖凝胶电泳分离及测序证实shRNA序列符合预期。p—sh—Beclinl-1、P—sh—Beclinl-2、P—sh—Beclinl-3及p-shRNA—NC转染后AR42J细胞BeclinlmRNA表达抑制率分别为（17．8±4．0）％、（30．6±2．8）％、（45．8±7．7）％、（7．0±11．8）％。3个p—sh—Beclinl转染细胞的表达抑制率均较未转染细胞显著增加，差异有统计学意义（P值均〈0．05），而转染P—shRNA—NC细胞的表达抑制率与未转染细胞的差异无统计学意义。抑制率最高的p—sh—Beelinl．3经慢病毒包装，感染AR42J细胞，感染细胞的BeelinmRNA表达抑制率为（86．1±1．2）％，蛋白表达抑制率为（87．9±2．8）％，与未感染细胞的差异均有统计学意义（P值均〈0．01）。结论成功建立Beclinl基因沉默的AR42J细胞株，为探讨Bedim基因在急性胰腺炎发病机制中的作用提供新的细胞模型。