siRNA干扰跨膜转运蛋白21的表达对KO小鼠胚胎成纤维细胞γ分泌酶活性的影响

目的探讨跨膜转运蛋白21(TMP21)对γ分泌酶活性的影响。方法将淀粉样前体蛋白基因缺陷型KO小鼠胚胎成纤维细胞[MEF(KO)]分为转染组(T)和对照组(C),转染组转染载有TMP21小分子干扰RNA(siRNA)的质粒,对照组转染空质粒。每组均制备包含细胞全膜蛋白的样品(T1、C1),经CHAPSO进一步溶解后超速离心制备所得纯化全膜蛋白样品(T2、C2),用γ分泌酶组分早老蛋白1(PS-1)特异性抗体免疫沉降C2或T2后获得的γ分泌酶样品(IPT2、IPC2)。蛋白质印迹法检测各类样品中γ分泌酶重要组分TMP21、PS-1和Nicastrin(NCT)蛋白表达量;应用ELISA法检测β淀粉样肽40和β淀粉样肽42的生成总量。结果蛋白质印迹法检测显示,TMP21蛋白表达量在转染组样品IPT2中为5294±247ng/ml,在对照组样品IPC2中为19110±579ng/ml,组间差异有统计学意义(P<0.05);各类样品中PS-1与NCT蛋白表达量无明显变化;TMP21可与PS-1共沉降。ELISA法检测显示,转染组样品IPT2与饱和浓度底物C99反应生成的β淀粉样肽40和β淀粉样肽42总量为348±18pg/ml,对照组样品IPC2为与饱和浓度底物C99反应生成的β淀粉样肽40和β淀粉样肽42总量为342±18pg/ml,组间差异有统计学意义(P<0.01)。结论TMP21可能为γ分泌酶的组分之一。在TMP21蛋白低表达状态下γ分泌酶活性升高,提示TMP21为γ分泌酶的负调控因子之一。

miRNA21/PDCD4环路在卵巢癌组织中的表达

目的探讨miRNA21/PDCD4环路在卵巢肿瘤中的作用及其临床意义。方法采用qRT-PCR和Western blot方法检测miRNA21和PDCD4在108例卵巢癌患者、67例交界性病变、75例良性病变和35例正常组织中的表达情况。结果 miRNA21在卵巢癌组织中的表达水平是正常卵巢组织的12.3倍(P<0.01);在交界性病变组织中的表达水平是正常卵巢组织的7.8倍(P<0.01);在良性病变组织中的表达水平是正常卵巢组织的3.6倍(P<0.05)。PDCD4蛋白含量在卵巢癌组织中的表达明显低于交界性病变组织,交界性病变组织低于良性病变组织,良性病变组织低于正常卵巢组织,两两相比差异均具有统计学意义(P<0.05),正常卵巢组织与卵巢癌和交界性病变组织中PDCD4蛋白含量相比差异有统计学意义(P<0.01)。结论 miRNA21/PDCD4环路异常在卵巢癌发生中具有重要的作用。

超表达转运膜蛋白21对介导阿尔茨海默氏病γ分泌酶复合物重要组分PS-1及NCT蛋白表达量的影响

研究转运膜蛋白21(TMP21)在小鼠胚胎成纤维细胞中超表达对PS-1及NCT蛋白表达量的影响.脂质体介导TMP21 cDNA转染敲除淀粉样前体蛋白表达基因的小鼠胚胎成纤维细胞系(MEF(KO)),以梯度浓度G418筛选TMP21表达量最高的细胞.处理超表达组(T)和对照组(C)细胞,并收集纯化过程中含γ分泌酶复合物的样本,用Western blotting检测γ分泌酶复合物重要组分Nicastrin(NCT)、Presenilin-1(PS-1)以及TMP21的蛋白表达量.结果表明,样本T1、T2及IPT2所含TMP21的蛋白表达量较相应对照组样本C1、C2和IPC2分别上升11.5%(P=0.08)、28.1%(P<0.01)及69.1%(P<0.001),提示经TMP21 cDNA转染后MEF(KO)细胞中TMP21蛋白表达明显提高,而转染组和对照组中,构成γ分泌酶复合物的重要组分NCT与PS-1蛋白表达量无明显变化.这表明在TMP21蛋白高表达状态下,不会影响MEF(KO)细胞中γ分泌酶复合物的重要组分NCT与PS-1蛋白表达量.

重组热带螨Blo t 21变应原诱导小鼠变态反应气道炎症模型的建立

为了建立热带螨重组变应原Blo t 21(rBlo t 21)诱导小鼠变态反应气道炎症模型,笔者利用从NCBI Gen Bank库里获得的热带螨Blo t 21基因序列,进行了序列优化与全基因合成,构建了原核表达载体PQE80LrBlo t 21,在大肠杆菌内诱导表达rBlo t 21,利用镍柱亲和层析纯化rBlo t 21蛋白。12只BALB/c小鼠随机分为对照组(PBS组)与诱导组(rBlo t 21组),每组6只,通过腹腔注射致敏与气道诱导后,分别通过酶联免疫吸附试验(ELISA)检测血清总IgE水平;鼠尾静脉注射变应原诱发应激性过敏反应;HE染色观察小鼠肺部炎症严重程度。本试验成功表达与纯化了重组热带螨变应原Blo t 21。利用纯化的rBlo t 21诱导小鼠变态反应气道炎症模型,与PBS组相比,rBlo t 21组的小鼠血清总IgE水平显著升高,肺部组织细胞侵润明显增加(P<0.05)。原核表达纯化的重组Blo t 21变应原能够诱导小鼠产生变态反应气道炎症。

非小细胞肺癌TCF21基因表达及其启动子区甲基化的研究

目的探讨非小细胞肺癌（NSCLC）中TCF21基因mRNA和蛋白的表达水平及其启动子区甲基化状态的意义。方法运用RT—PCR、蛋白印迹法（Western—blot）和焦磷酸测序（Pyrosequencing）技术检测97例非小细胞肺癌组织和21例支气管扩张或肺大疱等手术切除的良性肺组织中TCF21基因mRNA、蛋白表达及启动子区甲基化状态。结果97例NSCLC癌组织和21例良性肺组织中分别检测出TCF21基网mRNA阳性表达23例（23．71％）和14例（66．67％）；NSCLC癌组织中TCF21蛋白平均表达量灰度值为0．49±1．78，良性肺组织中其平均表达量灰度值为1．48±1．58；NSCLC癌组织和良性肺组织叶1TCF21摹因启动子区均有不同程度的甲基化，且癌组织和良性肺组织中各个位点甲基化频率均有统计学意义，在NSCLC癌组织中第1、5位点平均甲基化频率较高为49．04％和51．37％。结论TCF21基因mRNA及蛋白表达在NSCLC痈组织和良性肺组织中均有统计学意义，TCF21基因启动子区平均甲基化频率明屁高于良性肺组织细胞。

姜黄素对乳腺癌细胞株MCF-7中miR-21的影响及其意义研究

目的:探讨姜黄素对人乳腺癌细胞株(MCF-7)中miR-21表达的影响及其意义。方法:采用浓度分别为2.5μmol/L,5μmol/L,10μmol/L,20μmol/L的姜黄素处理MCF-7细胞株,采用实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(Realtime PCR)的方法检测其miR-21的表达。免疫印迹法(Western blot)方法检测miR-21调控的目的蛋白PDCD4的表达。结果:随着姜黄素浓度的升高,miR-21的表达量明显下降,目的蛋白PDCD4的表达量明显上升。结论:在乳腺癌细胞中,姜黄素通过调控miR-21及其目的蛋白的表达而发挥明显抑制肿瘤细胞增殖的作用。

弓形虫ROP21基因的原核表达与免疫学鉴定

目的原核表达弓形虫棒状体ROP21基因,并对rROP21蛋白进行免疫学鉴定。方法根据已发表的ROP21基因序列设计引物,通过RT-PCR方法扩增弓形虫RH株的ROP21基因。将ROP21基因克隆到原核表达载体pET-28a(+)后转化大肠埃希菌BL21(DE3)感受态细胞,IPTG诱导表达目的蛋白,纯化后进行SDS-PAGE分析、Western blot及IFA分析。结果经PCR和酶切鉴定,成功构建重组表达载体。重组质粒转化BL21(DE3)后经IPTG诱导,重组蛋白(rROP21)以包涵体形式高效表达,分子质量单位约为45ku。Western blot显示重组rROP21蛋白能被his标签抗体及弓形虫病患者血清识别。用rROP21免疫小鼠,获得滴度为1∶104的抗体血清。IFA显示弓形虫速殖子体内存在ROP21蛋白。结论构建的重组质粒pET28a-ROP21表达的弓形虫rROP21具有抗性,可作为血清学诊断候选抗原,为进一步研究其生物学功能奠定了基础。

热带无爪螨主要变应原Blo t 21抗原表位的预测

目的预测热带无爪螨主要变应原Blo t 21的抗原表位。方法利用DNAStar Protean软件分析热带无爪螨主要变应原Blo t 21的二级结构和表面特性,如理化性质、亲水性、表面可及性、柔韧性等,预测Blo t 21蛋白的B抗原表位和T抗原表位,同时利用Bepi Pred在线分析预测其可能的B细胞抗原表位。结果 Blo t 21蛋白的二级结构以α螺旋为主,存在7个潜在的B抗原表位位点,可能的B抗原表位区域有:2-11,19-28,35-54,55-70,72-83,96-112,123-129氨基酸残基或其附近。含有8个潜在的T细胞抗原表位区域:13-17,22-31,37-46,51-64,69-75,80-84,95-99,102-105氨基酸残基或其附近。结论应用Protean软件和Bepi Pred在线预测了热带无爪螨主要变应原Blo t 21的抗原表位,为进一步研究Blo t 21变应原的结构与功能,研制针对热带螨的预防性和治疗性疫苗、开发相应的诊断试剂盒奠定了基础。