生物钟基因与哺乳动物生殖

近日节律是生物节律中最重要的一种。它是一种以近似24 h为周期的自主振荡器,普遍存在于生物界中。近日节律主要受生物钟基因的调控,在哺乳动物中已发现时钟基因(Clock)、周期基因(Period,Per)家族、隐花色素基因(Cryptochrome1,Cry)家族、Bmal1(Brain and muscle ARNT-like 1)在内的多种重要的生物钟基因。这些基因及其蛋白质产物构成的反馈调节环是生物钟运行的分子基础。研究表明,生物钟基因不仅仅在近日节律的中枢系统中存在表达,在外周组织中也存在表达。而且生物钟基因与哺乳动物生殖密切相关,提示可能在生殖领域中具有重要的调控作用。主要从几个关键生物钟基因的发现、在近日节律和非近日节律中的调节作用、以及与哺乳动物生殖的关系做一综述。

异钩藤碱对血管平滑肌细胞中Baml1、Clock基因表达的调节作用

目的研究异钩藤碱对血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)诱导的血管平滑肌细胞(VSMC)中时钟基因(Bmal1、Clock)昼夜节律表达变化的调节作用。方法以AngⅡ诱导胸主动脉平滑肌细胞(A7r5细胞)建立节律变化模型。实验分AngⅡ诱导组、异钩藤碱组、正常对照组。AngⅡ诱导组以终浓度为100 nmol.L-1的AngⅡ诱导24 h,异钩藤碱组加入终浓度为100 nmol.L-1的AngⅡ和12 mg.L-1异钩藤碱处理24 h。采用Real-time PCR方法检测不同时间点VSMC中Bmal1、Clock基因表达水平,比较各组之间节律参数的差异。结果异钩藤碱通过调节AngⅡ诱导的A7r5细胞中的Baml1、Clock基因表达,改变其中值、振幅及峰相位,使A7r5昼夜节律发生改变。结论异钩藤碱对A7r5细胞中Baml1、Clock基因的昼夜节律的表达有调节作用。

冠心康对ApoE基因敲除动脉粥样硬化小鼠心脏时钟基因昼夜节律的影响

目的:观察中药复方制剂冠心康对Apo E基因敲除动脉粥样硬化小鼠血管壁保护及斑块的稳定作用及心脏时钟基因的调节,探讨中药干预高脂血症、动脉粥样硬化,防止心血管疾病发生的可能机制。方法:在12 h光照/黑暗条件下,54只Apo E-/-小鼠西方膳食饲料饲养至12周龄并随机分为3组,模型组、冠心康组以及辛伐他汀组,每组18只。另18只C57BL/6/J小鼠直接分至正常组。正常组及模型组每日给予生理盐水灌胃,辛伐他汀以及冠心康组每日分别予以相应药物灌胃。观察至19周龄取材。设定昼夜时点(Zeitgeber time,ZT),并根据ZT于ZT0、ZT4、ZT8、ZT12、ZT16与ZT20依次取材;采用HE染色法观察载脂蛋白E基因敲除动脉粥样硬化小鼠主动脉壁损伤情况;运用RT-PCR检测技术,检测载脂蛋白E基因敲除动脉粥样硬化小鼠心脏时钟基因Bmal1、Per2 mRNA表达水平。结果:病理研究结果提示冠心康具有一定的抗动脉粥样硬化作用。ApoE基因敲除动脉粥样硬化小鼠心脏时钟基因昼夜表达节律与正常组比较,显著改变,提示Bmal1、Per2存在昼夜表达异常;冠心康可显著调节Bmal1及Per2基因表达昼夜节律。其中与模型组相比,冠心康组小鼠心脏Per2基因在早上8点、下午16点以及午夜0点表达含量有显著差异,P<0.05。其中在下午16点表达显著升高,而在上午8点及午夜0点表达显著降低。与模型组相比,冠心康组小鼠心脏Bmal1基因在早上8点及午夜0点表达含量均显著升高,P<0.05,其基因表达水平与正常组较为相似。结论:冠心康对ApoE基因敲除动脉粥样硬化小鼠存在抗动脉粥样硬化的作用;冠心康对ApoE基因敲除动脉粥样硬化小鼠心脏时钟基因Bmal1、Per2基因表达节律存在干预作用,可能是中药干预动脉粥样硬化的分子机制之一。

泽泻提取物对自发性糖尿病大鼠Bmal1(Arntl)、Acsl5、Gpx1基因表达的影响

目的:通过观察泽泻提取物对自发性糖尿病(GK)大鼠Bmal1(Arntl)、Acsl5、Gpx1基因表达的影响,以期揭示泽泻降低血糖、血脂可能的基因基础从而为临床应用提供理论依据。方法:GK大鼠随机分为泽泻组(n=9)和空白组(n=9),泽泻组给予提取物0.1 mL(30 mg)每100 g大鼠体重灌胃,1 d2次(约为人用量30 g.d-1),空白组给予等体积生理盐水。给药30 d后,麻醉取肝脏,抽提总RNA,反转录后,定量RT-PCR分析各基因mRNA表达量。结果:泽泻提取物极显著抑制了Bmal1基因的高表达(P<0.001),而对Acsl5、Gpx1的表达无显著影响(P>0.05)。结论:泽泻降低血糖、血脂并用于糖尿病治疗的机制可能与其抑制Bmal1的高表达有关。泽泻对GK大鼠Bmal1、Acsl5、Gpx1基因的调控方式与中医"治未病"以及"治本"的理念相一致。

D-Ser2-Oxyntomodulin改善Aβ31-35所致小鼠昼夜节律紊乱

目的:观察胃泌酸调节素类似物D-Ser2-Oxyntomodulin(Oxy)是否可以改善β淀粉样蛋白31-35(Aβ31-35)所致的小鼠昼夜节律紊乱,探讨Oxy改善Aβ31-35所致昼夜节律紊乱的细胞分子机制。方法:(1)选取6~8周龄C57BL/6雄性小鼠进行跑轮行为学实验,分析Oxy改善Aβ31-35所致小鼠昼夜节律紊乱的作用。(2)选取小鼠海马HT22神经细胞,CCK8法检测细胞存活率,Real-time PCR检测不同时间点钟基因Bmal1和Per2 mRNA的变化趋势,Western Blot分别检测CT20时Bmal1蛋白和CT16时Per2蛋白的表达情况。结果:(1)Aβ31-35引起小鼠昼夜节律紊乱,与对照组相比,自由运转周期显著延长。Oxy预处理再给予Aβ31-35后小鼠的昼夜节律紊乱情况有所改善,与Aβ单独给予相比,自由运转周期显著降低。(2)Aβ31-35引起HT22细胞存活率显著降低,Oxy预处理后有效逆转Aβ31-35诱导的细胞存活率下降,且具有剂量依赖性。(3)经Aβ31-35处理后,HT22细胞的Bmal1和Per2 mRNA水平分别在CT20和CT16较对照组明显降低;而Oxy预处理组Bmal1和Per2的异常表达均得到显著改善。(4)与对照组相比,Aβ31-35组CT20时Bmal1和CT16时Per2蛋白水平显著降低;而与Aβ31-35组相比,Oxy预处理组Bmal1和Per2蛋白水平有所升高。结论:Oxy可能通过调整Bmal1和Per2的表达改善Aβ31-35所致C57BL/6小鼠昼夜节律紊乱。

热疗对人胃癌细胞MKN28的细胞周期及节律基因Bmall影响的实验研究

目的研究加热对胃癌MKN28细胞周期变化是否与节律基因Bmall表达相关，为胃癌择时热疗提供理论依据。方法体外复苏和培养胃癌细胞MKN28；对照组37℃下培养，实验组43qC分别加热0．5h、1.0h和1．5h，用显微镜观察细胞形态变化，采用四甲基偶氮唑盐比色法（MTT）检测细胞增殖抑制率；采用流式细胞术检测细胞周期分布的变化；采用实时定量逆转录一聚合酶链反应（RT-PCR）检测Bmall基因表达变化。结果加热后细胞形态发生显著变化，MTT实验提示37℃加热对细胞生长无明显抑制，细胞43℃热疗0．5h、1．0h和1．5h后细胞抑制率分别为（21．76±4．36）％、（25．30±4．36）％和（27．62±3．78）％，处理后细胞的增殖均受到抑制且抑制趋势具有时间依赖性；流式细胞术显示43℃加热1h后GO^G1最短而G2／M最长，同时实时定量RT-PCR结果显示BmallmRNA表达最低，细胞周期GO-G1变化规律和BmallmRNA变化规律一致。结论热疗可改变胃癌细胞周期及钟基因Bmall表达，提示择时执疗的可行件．