家蚕素Ⅱ基因原核表达及蛋白纯化

【目的】建立一种简便、快速且能大量获得家蚕素Ⅱ(bombyxin-Ⅱ,BBXⅡ)的有效方法。【方法】运用RTPCR技术得到bombyxin-Ⅱ基因全长cDNA序列,采用原核表达技术对该基因进行异源表达,并利用亲和层析的方法得到纯化的BBXⅡ蛋白。【结果】从家蚕Bombyx mori头部mRNA中经过反转录获得bombyxin-Ⅱ基因的cDNA,并构建了原核表达载体pET28a-BBXⅡ,经过异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导,使BBXⅡ获得了大量表达,进一步用HisTrap HP亲和层析,成功得到大量纯化的BBXⅡ。【结论】本实验建立的原核表达方法和蛋白纯化技术,是大量制备BBXⅡ的一种简易而有效的方法,为进一步开展BBX的分泌机制和作用机理研究,以及利用原核表达系统研发BBX降血糖药物奠定了基础。

糖尿病诱导剂链脲佐菌素与原核表达的家蚕素Ⅱ对家蚕血糖含量的影响

为探讨高等动物糖尿病诱导剂对家蚕血糖含量的影响以及鉴定原核表达的家蚕素Ⅱ（BBXⅡ）的降血糖活性,通过给家蚕幼虫注射糖尿病诱导剂链脲佐菌素和BBXⅡ,调查家蚕的生理效应及血糖含量变化。分别以50-500μg/g的剂量给4龄24 h幼虫注射链脲佐菌素后12--48 h,会引起蚕体血液中的海藻糖含量升高,但与对照组的差异不显著;以250μg/g的剂量给5龄24 h幼虫注射链脲佐菌素后6 h,血液中的海藻糖含量显著升高,海藻糖酶活性显著降低。蚕体注射链脲佐菌素后表现出不同程度中毒症状,生长发育、存活率、茧质、眠性及后代的滞育性等均受到不同程度的影响。半定量RT-PCR检测表明,链脲佐菌素会导致家蚕体内BBX-Ⅱ基因的表达量下调,其中对4龄期幼虫的影响大于5龄期幼虫。用原核表达的BBXⅡ注射正常饲养的家蚕幼虫、饥饿后进食的幼虫和经链脲佐菌素处理的幼虫,均可引起血液中海藻糖含量显著降低和海藻糖酶活性升高,显示原核表达的BBXⅡ对家蚕具有降血糖活性。

家蚕素Ⅱ基因真核表达载体的构建

目的构建(BbxⅡ)基因真核表达载体,为研究家蚕素Ⅱ在哺乳动物细胞中的生物学作用奠定基础。方法以含有BbxⅡcDNA的PUC57质粒为模板,采用聚合酶链式反应(PCR)扩增BbxⅡcDNA片段。真核表达载体PcD-NA3.1及PCR产物经双酶切后连接,转化大肠杆菌DH-5α感受态菌,获得重组载体PcDNA3.1-Bbx/His,进行酶切鉴定和测序鉴定。结果 PCR获得与预期大小一致约300 bp的特异性DNA,重组载体PcDNA3.1-BbxⅡ/His经双酶切及测序鉴定证实,BbxⅡ基因的cDNA片段正确插入真核表达载体中。结论成功构建含有家蚕素基因Ⅱ的真核表达载体。

家蚕类胰岛素肽的结构及信号传导与作用

胰岛素(insulin)及其信号传导途径具有多种生物学效应,在调节生物的生长、代谢、生殖以及衰老等过程中起到非常重要的作用。国内外学者的研究表明:家蚕素(bombyxin)是无脊椎动物中首个被鉴定的类胰岛素肽,分子质量5kD,为异二聚体分子,与人胰岛素的氨基酸组成约有40%的同源性,家蚕素基因为基因组多拷贝基因,已发现的32个家蚕类胰岛素肽家族基因都无内含子,分成7个亚族,集中在基因组的3个片段,并以3种特有的基因排列模式排列;家蚕素基因主要在脑组织表达,在其他组织的表达量较低;家蚕素由脑中央背部的4对大型神经分泌细胞合成,通过神经轴突运送至对侧的咽侧体,然后释放到血淋巴液中,是一种由超日振荡放电节律所控制的分泌模式;家蚕素参与了糖代谢调控,有促进翅芽和造血器官细胞增殖,调控前胸腺分泌活性等作用。家蚕素信号通路的Pi3k60、Pdk、InR和Akt同源基因已相继被克隆,其中Akt编码的蛋白保守性最强,并能被商业化供应的抗哺乳动物丝氨酸-苏氨酸激酶(AKT)和磷酸化AKT抗体识别,为家蚕素信号系统研究提供了便利。鉴于家蚕变态和能量代谢等诸多特点,以家蚕作为模式生物研究胰岛素及其信号传导途径具有独特优势。

家蚕类胰岛素信号通路及其功能的研究进展

胰岛素(insulin)及其信号传导途径在细胞中发挥调节糖、脂肪和蛋白质代谢,影响生物的生长、代谢、生殖、衰老等功能[1]。自首个昆虫类胰岛素—家蚕素(Bombyxin)在家蚕体内被发现以来,其结构、分布、调控基因、分泌控制及其在生理学上的功能已部分被阐明。家蚕素一级结构与人胰岛素大约有40%的同源性,主要在家蚕脑组织中表达,其代谢调控作用等相关研究已取得较大进展。本文将在相关文献基础上对家蚕素信号通路及其在调控家蚕代谢、生长及发育的研究进展上做一综述。

球孢白僵菌毒素对家蚕糖代谢水平的影响

为明确球孢白僵菌毒素对宿主昆虫糖代谢水平的作用,本研究检测了家蚕幼虫感染球孢白僵菌和注射球孢白僵菌毒素之后组织中海藻糖和糖原含量的变化,以及糖代谢相关基因表达水平的变化;分析了注射毒素和添食海藻糖之后对家蚕幼虫存活率的影响、以及添加毒素之后对BmN细胞的损伤作用。结果表明,家蚕幼虫感染球孢白僵菌和注射毒素后海藻糖和糖原含量显著降低;Bombyxin A2和BmIBP2基因显著上调表达,而糖代谢酶系基因则显著下调表达。注射毒素显著降低家蚕5龄幼虫的存活时间,而补充海藻糖能够延长家蚕幼虫的存活时间。添加毒素能够使家蚕BmN细胞发生凝集作用而最终崩解死亡,并诱导Bombyxin A2和BmIBP2基因显著上调表达以及糖代谢酶系基因显著下调表达。以上结果说明,球孢白僵菌可能通过分泌毒素,作用于家蚕类胰岛素信号通路,调节家蚕自身糖类物质的代谢与合成,破坏家蚕能量代谢与储存平衡,引起家蚕组织细胞凋亡并最终导致家蚕死亡。本研究结果对农林害虫的生物防治、家蚕等经济昆虫僵病防治技术的研究以及球孢白僵菌毒素用于新型降糖药物的筛选和中药僵蚕的开发利用均具有重要意义。