造血生长因子对长期培养中骨髓造血细胞增殖和分化的影响

应用骨髓长期培养法研究了ＨＧＦｓ联合应用对ＬＴＢＭＣ中造血干／祖细胞的增殖、分化的影响，结果显示，在ＬＴＢＭＣ中，含有ＨＧＦｓ（ＩＬ３＋ＩＬ６＋ＧＣＳＦ＋ＧＭＣＳＦ＋Ｅｐｏ）的扩增组与对照组相比，ＨＧＦｓ能显著地扩增ＨＳＣｓ，在第一周，ＣＦＵＧＭ，ＣＦＵＥ和ＢＦＵＥ总数分别扩增了１８０９１６５９倍、１０２６８４８倍和１４９９１２７８倍，而累积扩增倍数分别达３６１９６６３６倍、２０５１３３９０倍和２９９８５１１３倍，有核细胞总数扩增了１６９１９８倍，累积扩增了３９６６９７倍，但２周后各种集落数及大型ＣＦＵＧＭ集落数下降明显加快。结果提示：ＨＧＦｓ组合应用结合长期培养能扩增造血干／祖细胞，并能提高悬浮细胞的生存率；ＨＧＦｓ的组合在扩增ＨＳＣｓ的同时也促进了其分化；对骨髓造血微环境的建立也具有促进作用，在适当的时间内，应用小容量骨髓单个核细胞在体外长期培养扩增体系中可持续地扩增，扩增的造血干／祖细胞具有重要的临床应用潜能。

小鼠MSCs分离体外扩增及向神经样细胞诱导分化的研究

目的:研究小鼠骨髓间充质干细胞(mMSCs)的分离、体外扩增及向神经样细胞分化的潜能。方法:取 8-9周小鼠骨髓悬浮至全培养基中,接种于纤连蛋白覆盖的培养器皿中,纯化并扩增mMSCs;检测第9-10代细 胞的生长状态、细胞周期、表型,并进行光镜形态学观察;用二甲基亚砜和丁羟茴醚诱导细胞分化,免疫荧光法检测 其诱导分化前后神经细胞和神经干细胞的特异性标记蛋白的表达。结果:mMSCs为贴壁细胞,表现为成纤维细胞 样,具有梭形、多角形等形态,传至15代仍可维持其形态特征;83%的细胞处于G0/G1期;mMSCs不表达CD45而 表达CD44、CD13,与人MSCs表型一致;诱导分化后,大部分细胞变成双极、多极和锥形,并相互交织成网状结构, 呈现神经细胞和神经干细胞表型。结论:mMSCs可被成功分离及体外扩增培养,并具有同人类MSCs相同的形 态、表型、生长特征和向神经样细胞分化的潜力,是研究细胞及基因治疗小鼠病理模型的良好工具细胞。

骨髓内皮细胞条件培养液对巨核系细胞体外增殖的影响

目的 :探讨骨髓内皮细胞条件培养液 (E CM)对巨核系细胞体外增殖的调节作用。方法 :分离纯化骨髓内皮细胞和骨髓成纤维细胞 ,分别收集其无血清条件培养液 ,比较两种无血清条件培养液对体外扩增成熟巨核细胞和巨核系祖细胞的作用。结果 :E CM和骨髓成纤维细胞条件培养液 (F CM )对成熟巨核细胞及巨核系祖细胞有体外扩增作用 ;E CM对巨核系祖细胞的扩增作用明显优于F CM (P <0 .0 5 ) ;对成熟巨核细胞的扩增作用弱于F CM(P <0 .0 1 )。结论 :E CM对巨核系细胞 。

不同细胞因子组合对c-kit^+Lin^-细胞的体外扩增研究

目的探讨在无血清无基质条件下,不同细胞因子组合对c-kit+Lin-细胞增殖效应以及最佳扩增时间。方法采用免疫磁珠法分离小鼠骨髓c-kit+Lin-细胞,将干细胞因子(stem cell factor,SCF),FLt-3配基(FLt-3 ligand,FL),血小板生成素(thrombopoietin,TPO),白细胞介素-3(interleukin,IL-3),肝细胞生长因子(hepatocyte graoth factor,HGF)等细胞因子进行不同组合,体外扩增干细胞14d,于不同时间检测细胞总数和c-kit+Lin-细胞数及比例,并在第10天通过细胞凋亡早期膜变化标记FIFT-Annexin-V,检测细胞凋亡率。结果各组细胞因子均能显著扩增c-kit+Lin-细胞,扩增倍数3～19倍不等。在SCF+FL+TPO中加入IL-3或HGF,其效果更明显,c-kit+Lin-细胞在第6天分别扩增4.71和5.15倍,当同时加入时,两者有协同作用。其中SCF+FL+TPO+IL-3+HGF在第10天扩增程度最为显著,并且凋亡率最低为6.59%。结论在体外短期培养过程中上SCF+FL+TPO+IL-3+HGF组合能产生大量的c-kit+Lin-细胞,并且最佳培养时期为第10天,为肝干细胞提供种子细胞。

小鼠骨髓内皮细胞条件培养液体外扩增胚胎及成体造血干/祖细胞的差异及其机制探讨

本研究比较小鼠骨髓内皮细胞条件培养液 (mBMEC CM)联合FL和TPO对卵黄囊和骨髓造血干 祖细胞体外生长的影响 ,并对其机制进行探讨。取卵黄囊和骨髓单细胞悬液 ,对照组中加入含 10 %FBS的DMEM ,实验组分别加入 10 %mBMEC CM ,FL(5ng ml)和TPO(2ng ml) ,10 %mBMEC CM复合FL和TPO培养 2 4小时后进行集落培养 ,计数CFU GM和HPP CFC的集落数。应用AtlascDNAExpressionArray对卵黄囊和骨髓造血细胞表达的细胞因子受体进行检测。结果表明 :mBMEC CM能扩增卵黄囊和骨髓CFU GM和HPP CFC ,其与FL和TPO联合后扩增能力明显增强 ;mBMEC CM扩增骨髓CFU GM和HPP CFC的能力明显强于其扩增卵黄囊CFU GM和HPP CFC的能力。检测到小鼠卵黄囊及骨髓造血细胞存在差异表达的细胞因子受体 ;卵黄囊造血细胞表达PDGF Rβ ,PDGF Rα和促肾上腺皮质激素释放因子受体 ,而在骨髓造血细胞中未检测到上述受体的表达 ;在骨髓造血细胞中表达的IFN γR ,GM CSFR ,多巴胺D2受体和卵泡刺激素受体则未在卵黄囊造血细胞中检测到mRNA的表达。结论 :mBMEC CM能支持卵黄囊和骨髓造血祖细胞的体外扩增 ,其与FL和TPO联合后扩增能力明显增强 ;mBMEC CM对骨髓造血祖细胞表现出更强的扩增作用。

人胎盘无细胞悬液对骨髓造血干/祖细胞的体外扩增作用

为了探讨人胎盘无细胞悬液对骨髓造血干 /祖细胞的体外扩增作用及与已知的几种细胞因子进行比较 ,用人胎盘无细胞悬液及IL 3,GM CSF ,IL 3+IL 6+GM CSF +EPO作为刺激因子 ,并应用甲基纤维素半固体培养体系对骨髓GM CFU ,GM GEMM和BFU E进行了培养和比较。研究结果表明 ,人胎盘无细胞悬液对骨髓CFU GM ,CFU GEMM和BFU E体外扩增最适蛋白浓度是 2 0 0 - 30 0μg/L ,人胎盘无细胞悬液作刺激因子对骨髓造血干 /祖细胞的体外扩增效果优于单独IL 3,单独GM CSF和IL 3+IL 6+GM CSF +EPO组。结论提示 ,人胎盘无细胞悬液可能含有多种细胞因子 ,用人胎盘无细胞悬液作扩增剂体外扩增骨髓造血干

重组白细胞介素2对骨髓造血祖细胞体外增殖的影响

为了了解重组白细胞介素２对骨髓造血祖细胞体外增殖的影响，应用体外半固体培养法研究了ｒｈＩＬ－２及其与ＧＭ－ＣＳＦ和Ｅｐｏ组合对骨髓祖细胞集落形成的调节作用。结果：ｒｈＩＬ－２单独对骨髓造血祖细胞的体外增殖无刺激作用；当其与ＧＭ－ＣＳＦ联合应用时，在浓度为１０．０×１０４～４０．０×１０４Ｕ·Ｌ－１时，ＣＦＵ－ＧＭ集落数明显高于ＧＭ－ＣＳＦ对照组；当其与Ｅｐｏ联用时，在浓度为１０．０×１０４～４０．０×１０４Ｕ·Ｌ－１时ＣＦＵ－Ｅ和ＢＦＵ－Ｅ集落数明显高于Ｅｐｏ单用组；但当其浓度升至１０．０×１０５Ｕ·Ｌ－１时，各种集落数均明显减少。重组人白介素２（ｒｈＩＬ－２）对骨髓造血祖细胞体外增殖的研究结果显示，在一定的浓度范围内，ｒｈＩＬ－２与ＧＭ－ＣＳＦ和Ｅｐｏ联合对骨髓造血祖细胞的体外增殖具有协同的刺激作用，单独应用无集落形成能力，大剂量应用可能会抑制骨髓造血。