白桦开花抑制因子BpFLC与BpSVP酵母表达载体的构建及互作验证

为深入研究白桦开花抑制因子FLC与SVP的相互作用的分子机理,利用PCR技术从白桦幼叶cDNA中克隆出BpFLC和BpSVP基因序列,利用NdeⅠ和EcoRⅠ限制性内切酶将BpFLC和BpSVP分别整合进酵母表达载体pGBKT7和pGADT7中。pGBKT7-BpFLC及pGBKT7-BpSVP转化酵母Y2Hgold菌株显示无自激活与毒性作用。酵母Y2Hgold[pGBKT7-BpFLC×pGADT7-BpSVP]、Y2Hgold[pGADT7-BpFLC×pGBKT7-BpSVP]均可在QDO/A/X平板上生长,并显示蓝色,说明能激活报告基因HIS3、ADE2、AUR1-C、MEL1,由此表明BpFLC与BpSVP蛋白能够结合,存在互作关系。

白桦开花抑制因子BpFLC与BpSVP蛋白互作的结构域筛选与互作验证

为深入研究白桦开花抑制因子FLC与SVP的相互作用的分子机理。从重组质粒pGBKT7-BpFLC、pGBKT7-BpSVP分别克隆出6个BpFLC截短体（BpFLC1～6）和6个BpSVP截短体（BpSVP1～6），分别编码MI、MIK、K、IKC、KC和C域。在酵母Y2HGold菌中，分别共转诱饵质粒pGBKT7-BpFLC1～6×pGADT7-BpSVP及pGBKT7-BpFLC×pGADT7-BpSVP1～6。酵母转化子Y2HGold[pGBKT7-BpFLC2～5×pGADT7-BpSVP]，可在选择性固体培养基TDO、QTO／A上生长，并在QDO／A／X上长出蓝色菌落，表明BpSVP能与截短体蛋白BpFLC2～5异源结合。此外酵母Y2HGold[pGBKT7-BpFLC×pGADT7-BpSVP2～5]也能同时激活报告基因AUR1-C、HIS3、ADE2、MEL1。进一步研究发现：Y2HGold[pGBKT7-BpFLC3×pGADT7-BpSVP3]存在相互作用，表明BpFLC的K域与BpSVP的K域能够异源结合，是介导BpFLC与BpVP蛋白互作的关键结构域。

白桦开花抑制因子BpFLC与BpSVP蛋白同源互作域筛选与分析

开花是植物由营养生长向生殖生长的转换点,该过程受内源基因与环境信号共同调控。FLC（Flowering locus C）和SVP（Short vegetative phase）是开花途径中关键的抑制开花因子。本文利用酵母双杂交技术深入研究白桦开花抑制因子FLC与SVP的自身聚合作用的分子机理。从重组质粒p GBKT7-BpFLC、p GBKT7-Bp SVP分别克隆出6个BpFLC截短体[BpFLC1（aa1～73）、BpFLC2（aa1～173）、BpFLC3（aa74～173）、BpFLC4（aa60～208）、BpFLC5（aa74～208）和BpFLC6（aa174～208）]和6个BpSVP截短体[BpSVP1（aa1～68）、Bp SVP2（aa1～172）、Bp SVP3（aa69～172）、BpSVP4（aa60～225）、BpSVP5（aa69～225）和Bp SVP6（aa173～225）],分别编码MADS型蛋白的MI、MIK、K、IKC、KC和C域。在酵母Y2HGold菌中,分别共转质粒pGBKT7-BpFLC1～6×pGADT7-BpFLC及p GBKT7-BpSVP×pGADT7-BpSVP1～6。酵母转化子Y2HGold[p GBKT7-BpFLC×p GADT7-BpFLC]、Y2HGold[pGBKT7-BpFLC2～5×pGADT7-BpFLC],可在选择性固体培养基TDO（SD/-Leu/-Trp/-His）、QTO/A（SD/-Leu/-Trp/-His/-Ade/Ab A）上生长,并在QDO/A/X（SD/-Leu/-Trp/-His/-Ade/AbA/X-α-gal）上长出蓝色菌落,表明BpFLC能与自身及截短体蛋白BpFLC2～5同源结合。此外酵母Y2HGold[pGBKT7-BpSVP×pGADT7-Bp SVP]、Y2HGold[pGBKT7-Bp SVP×p GADT7-BpSVP2～5]也能同时激活报告基因AUR1-C、HIS3、ADE2、MEL1,说明BpSVP能与自身及截短体蛋白BpSVP2～5同源结合。对保守区的序列结构进一步分析发现：BpFLC与BpSVP的K域是它们能够同源结合,介导BpFLC与BpSVP自身形成同源二聚体的关键。