大白菜AB-81高频再生系统的建立及gusA基因瞬时表达的研究

以大白菜自交系AB 81的子叶和真叶切块为外植体 ,建立了高频不定芽离体再生系统。在MS附加TDZ 0 .2mg/L ,NAA 2 .0mg/L ,AgNO310mg/L和ABA 0 .2 5mg/L的再生培养基上 ,子叶和真叶的不定芽再生频率分别达到 93.3%和 90 .0 % ,每块外植体的不定芽数达 3～ 6个 ,最多达 2 1个。以EHA10 5/pMOG4 10为载体转化侵染大白菜AB 81的子叶 ,获得较高gusA基因瞬时表达频率的条件为 :子叶预培养 2～ 3d ;侵染的工程菌液的浓度OD 0 .3～ 0 .5;侵染时间 2～ 10min ;共培养时间 2～

利用小孢子培养创建大白菜初级三体的研究

创建大白菜初级三体是开展基因染色体定位等细胞分子遗传学方面研究的基础。本研究从四倍体大白菜9405自交系游离小孢子培养获得的植株中,筛选出79个2n+1植株。通过根尖中期染色体核型分析,并结合减数分裂和植株外部形态特征观察,从中鉴定筛选出了一整套初级三体。各初级三体在植株的形态特征上表现出不同程度的差异。四倍体大白菜游离小孢子培养是创建初级三体的快捷简便的有效途径。

青研系列大白菜杂交种及亲本指纹图谱构建和杂种纯度鉴定

利用SSR分子标记技术构建了青研系列7份大白菜杂交种及其11个亲本的DNA指纹图谱,筛选出5对具有较高多态性的SSR核心引物,核心引物组合扩增,可以鉴别亲本及其杂交种的真伪。利用其中一对共显性SSR标记P3鉴定青研早9号、青研桔15和青研春白一号三个杂交种的纯度。对比苗期性状调查结果表明,SSR分子标记用于杂交种纯度鉴定结果是可靠的。本试验为大白菜杂交种纯度鉴定提供了可靠的方法,对亲本保护及杂交种推广具有重要意义。

大白菜分子连锁图谱的构建与分析

构建大白菜分子连锁图谱,旨在为紫色等性状的QTL定位奠定基础。以紫菜薹(B.compestris L.var.purpurea Bailey)和结球白菜(B.campestris L.ssp.Pekinensis(Lour.)Olsson)杂交的F2群体为试材,基于231个多态性标记,利用JoinMap3.0软件,得到包含163个标记、11个连锁群和4个片段的大白菜分子连锁图谱,其中包括117个RSAP标记、38个SRAP标记、5个SSR标记和3个RAPD标记。图谱覆盖基因组长度为821.3cM,标记间平均图距为5.04cM。连锁群上23.31%的标记表现偏分离,偏分离标记在连锁群上聚集出现。基于与紫色性状连锁的RAPD标记,推断LG4与大白菜1号染色体对应。该图谱可有效的用于紫色等性状的QTL定位分析。

大白菜与紫甘蓝种间杂种的获得与鉴定

以不同类型的大白菜与紫甘蓝为材料,运用蕾期授粉结合胚挽救技术获得大白菜与紫甘蓝的种间杂种,并对其进行细胞学鉴定。结果表明,大白菜与紫甘蓝杂交,获得了57株F1代幼苗;对根尖染色体数量进行观察和杂种花粉特性调查发现,其中47株具有预期的染色体数目,2n=19,鉴定为真杂种,其花粉败育;另有6株具有38条染色体,鉴定为种间异源双二倍体,应该是发生了染色体自然加倍,其花粉可育。可育的杂种F1代与大白菜回交,获得了大白菜—紫甘蓝BC1代材料。田间观测结果显示,杂种F1代植株综合性状均介于双亲之间,BC1代植株包球明显,综合性状偏向母本大白菜。

氯对白菜幼苗的生长及养分吸收的影响

采用土培实验,研究了外源氯(CK,低氯,中氯,高氯)对大白菜[Brassica campestris L.ssp.Pekinesis(Lour)Ols- son]幼苗叶绿素含量、根系活力以及对N、P、K养分吸收、累积的影响。结果表明:低浓度氯处理对大白菜幼苗没有明显的影响。中氯和高氯处理,都显著降低了白菜幼苗生物量、叶绿素含量和根系活力。随着氯浓度的升高,白菜幼苗叶片和根Cl^-含量显著升高,中氯处理Cl^-累积量最高,过量的氯降低了N、P、K养分在白菜幼苗体内的累积。氯胁迫抑制作物根系活力和光合作用从而减少主动养分的有效供应是造成生物量降低的主要原因。

大白菜下胚轴不定芽再生过程中内源激素和多胺含量的变化

研究了大白菜[Brassica campestris ssp．pekinensis(L．)Olsson]下胚轴不定芽再生过程中内源激素和多胺含量的动态变化。结果表明,芽原基出现以前(接种后0～8d)外植体内源玉米素核苷(ZRs)和脱落酸(ABA)含量上升,而吲哚乙酸(IAA)含量下降；不定芽出现(接种后8d)后变化趋势相反；ABA／IAA值和ZRs／IAA值在培养初期(接种0～8d)增大,不定芽出现以后逐渐减小。不定芽分化过程中外植体内源腐胺(Put)、精胺(Spm)和亚精胺(Spd)含量都表现为先上升后下降,均在培养第8d时达到峰值；Spm／Put值和Spd／Put值的变化趋势也与此相似。说明大白菜下胚轴不定芽的再生与内源激素和多胺含量及平衡有密切关系。

玻里马胞质大白菜雄性不育系CMS3411-7温度敏感特性的研究

采用光照培养箱恒温、变温和田间自然变温 ,研究大白菜玻里马胞质雄性不育系CMS 3411 7温度敏感的特性。结果表明 :在 3～ 15℃内CMS 3411 7均有育性转换 ,其中昼 /夜温度 8/ 4～ 14 / 10℃ (即日平均温度 6～ 12℃ )是有效转换的温度范围。在恒温 6℃条件下 ,经过 3～ 5d处理时CMS 3411 7的育性转换值 (不育级别 )可达到 2级 ,该温度下随着处理时间延长 (3～ 9d)不育性转换程度逐渐加重。在 9℃恒温下处理 6d较处理 3d和处理 9d时的转换程度都大。在 14 / 10℃下转换程度与处理时间无关。在 17/ 13℃下处理时间延长反而抑制不育性转换。虽然不同处理下CMS 3411 7不育性转换开始和转换结束的时间差异较大 ,但显著转换发生的时间一般稳定在温度处理后 10～ 2 7d ,表现相对集中。就育性转换的启动来看 ,经过 3d处理后 8/ 4～ 17/ 13℃下均发生了育性转换 ,说明

结球白菜高效离体子叶不定芽再生的研究

以2个日本优质结球白菜爱知结球白菜(C1)和新理想白菜(C2)的子叶为外植体,研究了不同激素配比、AgNO3浓度和苗龄对不定芽再生的影响.结果表明,与6-BA相比,TDZ对子叶不定芽再生的效果更好.在MS+0.5 mg·L-1 NAA+1 mg·L-1 TDZ培养基中,2个品种的子叶不定芽再生率分别达到75.0%和55.0%.在此基础上,添加5 mg·L-1 AgNO3时,C1和C2子叶不定芽再生率分别达到96.7%和80.0%,并以5～8 d为子叶不定芽再生的最佳苗龄.

白菜低温要求型晚抽薹性的相关序列克隆与分析

为了阐明低温要求型晚抽薹的分子机制,本研究利用易抽薹大白菜BY和晚抽薹芜菁"M.M"杂交获得的81个DH系群体为试材,从中选择了6个极早抽薹和6个极晚抽薹的株系分别组成早抽薹池和晚抽薹池。以两池和双亲为样本,以无低温和3～5℃处理25d后获得的mRNA为模板,反转录为cDNA,利用256对AFLP引物组合进行cDNA-AFLP分析,筛选与晚抽薹性相关的特异片段。对其中3条差异表达、且丰度较高的cDNA片段进行了克隆测序。序列测定和Blast分析表明,p65m47cDNA片段与C2结构域蛋白基因有80%的同源性,期望值为7e-17,C2结构域蛋白在细胞的信号转导中起着很重要的作用;p66m55cDNAⅠ片段与拟南芥AT1G32530cDNA有85%的同源性,期望值为5e-36,它编码蛋白结合位点/泛素连接酶/锌指结合蛋白;p66m55cDNAⅡ片段与拟南芥AT1G65590cDNA有87%的同源性,期望值为4e-37,它编码β-N-乙酰已糖胺水解酶。

铜处理对大白菜芝麻状斑点病发生及总酚含量的影响

选择感病品系03B9与抗病品系C24为试材,在水培条件下,研究不同铜浓度处理对大白菜芝麻状斑点病发生、总酚含量及多酚氧化酶活性的影响。结果表明:随着铜处理浓度的升高,两品系芝麻状斑点病的斑点数明显增加,03B9芝麻状斑点病发生程度明显高于C24。铜处理期间C24总酚含量、PPO活性较03B9平均高出25.6%和77.0%。试验结果初步表明,水培条件下铜胁迫促进了大白菜芝麻状斑点病的发生,铜浓度与芝麻状斑点病发生程度有关,同时影响了叶柄总酚含量及PPO活性。

大白菜黑斑病室内苗期抗性鉴定方法的研究

为了选育大白菜(Brassica campestris L.ssp pekinensis(Lour.)Olsson)抗黑斑病(Alternaria brassicae)新品种和种质创新,在室内利用6个品种的大白菜研究了接种物浓度、苗龄和温度对大白菜黑斑病发病的影响,结果表明,在(25±1)℃光照培养室内,选择浓度为1.0×104个孢子/mL或1.0×105个孢子/mL的黑斑病病菌孢子悬浮液喷雾接种于苗龄为3～4片真叶的大白菜幼苗,保湿24～48 h,10 d后进行病情调查,可对大白菜种质资源抗黑斑病的抗性进行正确评价。

大白菜下胚轴离体不定芽高效再生体系的研究

以大白菜的下胚轴为外植体,比较了不同浓度TDZ和6-BA两种细胞分裂素与不同浓度NAA相配合的培养基上不定芽再生的差异,并利用筛选出的高效再生培养基研究外植体苗龄、切段来源、接种方式以及品种对不定芽再生的影响.结果表明:与6-BA相比,TDZ对诱导下胚轴不定芽再生更有效,在MS+TDZ 0.3 mg·L-1+NAA 0.5 mg·L-1+AgNO3 5 mg·L-1的培养基上,下胚轴不定芽再生频率高达87.8%,平均每下胚轴再生不定芽数也达到15.1个;3～5 d苗龄之间的下胚轴不定芽再生能力无显著差异,再生频率均达到80%以上,此后随着苗龄的增加,不定芽分化频率快速下降,苗龄为7 d时再生频率只有51.1%;下胚轴不同切段不定芽再生能力由强到弱表现为:上部切段>中部切段>下部切段;以正插(形态学下端插入培养基)方式接种的外植体不定芽再生能力显著大于反插(形态学上端插入培养基)和平放的;不同品种大白菜下胚轴的不定芽再生能力有一定差异.

大白菜SRAP反应体系的建立与优化

以大白菜基因组DNA为模板,通过正交试验设计,从Mg2+、Taq酶、dNTPs、引物、模板5种因素4个水平对大白菜SRAP(Sequence-related amplified polymorphism,序列相关扩增多态性)反应体系进行优化,建立了适合于大白菜的SRAP-PCR优化反应体系,该体系为25μL:Mg2+浓度为3.0 mmol/L,dNTPs为0.2mmol/L,Taq酶1.5 U,引物为0.2μmol/L,模板DNA73.2 ng。PCR反应程序为:94℃预变性5 min;94℃变性1 min,35℃复性1 min,72℃延伸1 min,5个循环;94℃变性1 min,50℃复性1 min,72℃延伸1 min,35个循环,72℃延伸10 min。

大白菜BrAOP2基因的遗传多样性及其与硫甙含量的相关性分析

以大白菜品种Chiifu为试验材料,采用RT-PCR技术,克隆了3个硫甙合成关键基因BrAOP2基因的cDNA序列(BrAOP2.1、BrAOP2.2、BrAOP2.3)。通过氨基酸同源性比对分析,BrAOP2.1与BrAOP2.2的同源性为78%,BrAOP2.1与BrAOP2.3的同源性为74%,BrAOP2.2与BrAOP2.3的同源性为81%。通过32份大白菜重测序数据分析了3个BrAOP2基因CDS序列的遗传多样性,并对其与硫甙含量的相关性进行了分析。结果表明:在32份大白菜中共检测到7种硫甙,其中4-戊烯基硫甙(GBN)含量和2-羟基-3-丁烯基硫甙(PRO)含量较高,分别占总硫甙含量的23.99%和23.16%。在BrAOP2.1基因编码区检测到5个变异位点,在BrAOP2.2基因编码区检测到7个变异位点,在BrAOP2.3基因编码区仅检测到1个变异位点。其中BrAOP2.1基因的A1051G变异位点与PRO含量极显著相关,BrAOP2.2基因的A560G、C753T、A790G和T927C变异位点与PRO含量显著相关,BrAOP2.2基因的G825A位点与4-羟基-3-吲哚基甲基硫甙(4OH)含量显著相关。

接种方式对大白菜下胚轴离体不定芽再生及生理指标的影响

以大白菜品种‘贵龙5号’的下胚轴为材料，以3种不同方式接种，观察不定芽分化情况．并比较不同接种方式的下胚轴不定芽再生过程中可溶性蛋白质含量、过氧化物酶（POD）、超氧化物歧化酶（S（）D）和过氧化氢酶（CAT）活性的变化。结果表明，以正插（形态学下端插入培养基）方式接种的下胚轴在接种8～10d时不定芽开始产生，不定芽分化率达87．8％，平均每外植体再生的不定芽数为15．1个，其不定芽再生能力显著大于反插（形态学上端插入培养基）和平放的外植体；下胚轴在不定芽分化过程中各生理指标呈现规律性的变化，可溶性蛋白质含量、POD和SOD活性在芽原基形成以前表现出上升趋势而CAT活性下降，不定芽分化后呈相反变化趋势；不同接种方式的下胚轴在不定芽发生过程中各生理指标的变化有一定差异。以上结果表明大白菜下胚轴不定芽发生过程中形态学变化和生理变化紧密相关。

HRM技术在大白菜EMS突变体筛选上的应用研究

以大白菜抗霜霉病基因相关的1段DNA序列为目标片段,利用高分辨率熔解曲线技术(HRM),对EMS诱变大白菜12-2和12-7花蕾进行小孢子培养获得的92个DH单株,鉴定出7株12-2突变株,6株12-7突变株。针对其中9株进行了PCR片段测序,结果表明全部为点突变,主要包括4种突变类型,最易突变位点为C-T类型,其次为A-C和C-A类型,没有G-C突变类型。试验明确了高效筛选大白菜EMS突变体的分析流程,验证了HRM技术筛选大白菜突变体的可行性,为大量筛选大白菜突变体库奠定了基础。

秋冬季大白菜田节肢动物群落物种及功能团的时间生态位

采用Levins(1968)生态位宽度(Bi转化为Bi′)和Hurlbert(1978)生态位重叠(Lij)指标,对湖北荆州秋冬季大白菜(Brassicacampestris L. ssp. pekinensis(Lour)Olsson.)田节肢动物群落物种和功能团的时间生态位进行了分析,结果表明:害虫中优势害虫菜缢管蚜[Lipaphis erysimi(Kaltenbach)]的Bi′居中,为0.6389,甜菜夜蛾(Laphygmaexigua Hubner)、大猿叶虫(Colaphellus bowringiiBaly)与菜缢管蚜的Lij大于1;天敌中优势天敌八斑球腹蛛(Theridionoctomaculatum Boes.etStr.)和草间小黑蛛[Erigonidiumgraminicolum(Sundevall)]的Bi′较小,分别为0.7170和0.6645,三突花蛛(Misumenops tricuspidatus Fabrici-us)与八斑球腹蛛、青翅蚁形隐翅虫(Paederus fuscipes Curtis)与草间小黑蛛的Lij大于1;八斑球腹蛛、草间小黑蛛以及青翅蚁形隐翅虫与菜缢管蚜的Lij大于1。害虫功能团中蚜虫类的Bi′居中,天敌中功能团中蜘蛛类Bi′最大。蚜虫类与蝽类、潜叶蝇类、直翅类及叶蝉类的Lij大于1,蜘蛛类与瓢虫类及隐翅甲的Lij均大于1。蜘蛛类、瓢虫类、隐翅甲与蚜虫类的Lij均大于1。

大白菜萌动种子春化过程中生理生化指标的变化

研究了不同冬性大白菜[Brassica campestris L. ssp. pekinensis(Lour.)Olsson]萌动种子在2℃低温处理过程中,其硝酸还原酶(Nitric acid reductase,NR)活性、可溶性蛋白质含量及过氧化物酶(Peroxide enzyme,POD)同工酶、细胞色素氧化酶(Cytochrome oxidase,COD)同工酶和β-酯酶(Beta-esterase isozyme,β-EST)同工酶的电泳图谱变化。结果表明,萌动种子NR活性与大白菜的耐抽薹性密切相关,即随着耐抽薹性减弱NR活性降低,极耐抽薹品种萌动种子的NR活性是易抽薹品种的3～4倍,萌动种子中NR活性的高低在一定程度上可反映大白菜的耐抽薹特性。在春化过程中,极耐抽薹品种的萌动种子NR活性表现为先快速下降,然后维持一段低活性水平;易抽薹品种萌动种子的NR活性表现与之相反,先是快速升高,到春化处理的15d达最大值,然后快速下降。不同大白菜品种萌动种子可溶性蛋白质含量的变化趋势基本一致,表现为"上升-下降-上升"的倒"S"型变化;大白菜萌动种子在完成春化的时候陆续有Rf为0.788的特异蛋白出现。不同大白菜品种萌动种子的POD、COD和β-EST同工酶酶谱基本相同;春化20d以后,所有品种Rf为0.632的β-EST同工酶带从大白菜中消失,而POD和COD同工酶活性有所增加,且各材料均陆续出现自己特有的POD和COD同工酶带。

大白菜的组织培养研究

研究了不同外植体、激素组合、苗龄、AgNO3 、ABA等因素对耐热大白菜不定芽诱导率的影响。结果表明 :6日龄的子叶是最适外植体 ;在含有BA 1.5mg/L +NAA 0 .5mg/L的MS培养基上 ,添加AgNO3 4mg/L和ABA 0 .