Sox2、BrdU及Nestin作为干细胞标记物在室周器官干细胞研究中的应用及临床前景

探讨Sox2、BrdU及Nestin这三种标记干细胞的因子在室周器官干细胞研究中的应用及临床前景。根据已获得的数据,分析出特定条件下不良反应与所采用的医疗干预措施之间的关系。方法 分析了111份样本的采集过程中不良反应的发生情况和与性别、年龄、循环血量等因素的关系,同时对对比了接受不同医疗干预措施后的结果。结果 在医疗干预措施中,雌性的病例对钙剂输入的需求较大。采用输入钙剂措施的情况下,口唇麻木和肢端麻木的发生率明显高于未采用的情况。结论 Sox2、BrdU及Nestin等因子在室周器官干细胞研究中具有重要作用,通过对不良反应的分析和医疗干预措施的选择,可以更好地指导临床操作,提高干细胞的采集效率。在临床实际应用中,应根据病人的具体状况,选择合适的医疗干预措施,既能提高采集效率,又能减少不良反应的出现。

抗BrdU单克隆抗体的制备及初步鉴定

溴脱氧尿嘧啶核苷（Ｂｒｏｍｏｄｅｏｘｙｕｒｉｄｉｎｅ ＢｒｄＵ）是ＤＮＡ前体胸腺嘧啶核苷的类似物。通过检测ＢｒｄＵ掺入Ｓ期细胞ＤＮＡ的基因片段，可避免用同位素标记所产生的放射性污染等副作用。本文在过碘酸氧化法偶联抗原的基础上，已制备出具有均一分泌活性...

利用BrdU在CEF(TK^+)细胞中筛选TK^-重组鸡痘病毒

将新城疫病毒 (NDV)四平株 HN基因 ,插入不含报告基因、以 TK为侧翼的鸡痘病毒表达载体 p UTA- 2中的复合启动子下游 ,获得重组表达质粒 p UTA- 2 HN。将重组表达质粒转染鸡痘病毒 (FPV)感染的鸡胚成纤维细胞 (CEF) ,培养、收获病毒后 ,用含 40 m g/ L 5 -溴 - 2 -脱氧尿嘧啶 (Brd U )的培养液 ,在 CEF(TK+)细胞中筛选培养 2代 ,然后用不含 Brd U的培养液进行病毒蚀斑纯化 ,成功筛选出表达 NDV HN蛋白的

MTT法与BrdU ELISA法检测成纤维细胞增殖的可靠性比较

目的比较MTT法与B rdU ELISA法检测成纤维细胞增殖的可靠性。方法原代培养大鼠成纤维细胞,分别在细胞60%汇合和80%汇合时,以250 pg/m lTGF-β刺激细胞增殖,48 h后分别用MTT法和B rdU ELISA法,以及免疫组化方法检测细胞增殖情况。结果细胞60%汇合时MTT检测组和B rdU ELISA检测组与各自的对照组比较,比值分别为1.46和1.70,检测值近似;细胞80%汇合时二者分别为1.0和2.5,免疫组化结果显示TGF-β刺激组蓝染的增殖细胞明显高于对照组。结论与MTT法相比,B rdU ELISA更能客观地反映细胞增殖情况。

用BrdU法研究γ射线外照射诱发外周血淋巴细胞HPRT基因突变

用 5 -溴脱氧尿嘧啶 (BrdU)法检测 ,不同剂量γ射线外照射诱发正常人外周血淋巴细胞HPRT基因突变频率 (MFs) ,并研究其剂量效应关系。抽取正常成年人静脉血 ,分成 5组 ,分别用 0 .0— 4 .0Gy的不同剂量γ射线照射 ,全血培养后用BrdU法检测淋巴细胞HPRT基因MFs。结果表明 ,正常人外周血淋巴细胞的MFs随外照射剂量的增加而上升 ,且剂量效应关系符合线性平方模型。研究证明了BrdU法是一种快速、简便、较敏感的检测外照射诱发HPRT基因突变的方法 ,HPRT基因辐射突变可作为生物剂量计。

流式细胞仪BrdU/DNA双参数分析法测定急性白血病细胞周期及其临床意义

研究白血病细胞的增殖动力学,探讨其与临床的关系。采用流式细胞仪（FCM）BrdU/DNA双参数分析法测定39例急性白血病骨髓细胞周期的各时相细胞比例及S期细胞的时限（Ts）,其中ANLL26例,ALL13例;初治31例,复发8例（ANLL、ALL各4例）。结果显示,急性白血病骨髓细胞S期比例显著低于正常,初治及复发白血病患者骨髓S期细胞比例之间相差不显著;复发白血病患者骨髓细胞的Ts比初治白血病患者及正常骨髓细胞的Ts都短。提示白血病细胞处于较正常低增殖状态;Ts时限短提示白血病细胞再生迅速,与急性白血病复发关系密切;Ts时限短为白血病预后不良因素之一。

成人骨髓间充质干细胞的鉴定与体外BrdU标记

背景:目前尚未发现骨髓间充质干细胞独有的标志分子,给其鉴定带来一定困难。BrdU标记不存在放射性污染,有研究认为在不受到紫外线照射的条件下,BrdU标记后对细胞功能无损害。目的:探讨成人骨髓间充质干细胞体外鉴定和标记的方法,并观察其生物学特性。设计、时间及地点:细胞观察,于2007-06/12在解放军兰州军区兰州总医院完成。材料:成人骨髓来自5例健康志愿者。BrdU为美国Sigma公司产品。方法:采集成人骨髓10mL,密度梯度法分离单个核细胞,加入含10%胎牛血清的DMEM培养基,调整细胞密度为2×108L-1进行扩增培养。取第3代骨髓间充质干细胞,加入成骨诱导培养基,行碱性磷酸酶染色;加入成脂诱导培养基,行油红O染色;加入终浓度为5,10,15μmol/LBrdU溶液,孵育12,24,48,72,96h后行免疫细胞化学染色。主要观察指标:倒置光学显微镜下观察细胞生长及增殖情况,流式细胞仪鉴定细胞表型,成骨及成脂诱导分化结果。BrdU阳性标记率及标记后细胞生长情况。结果:①体外培养的成人骨髓间充质干细胞形态均一,为梭形或纺锤形的成纤维细胞样外观;表达CD44和CD71,不表达CD34和HLA-DR;可定向诱导分化为成骨细胞和脂肪细胞。②大部分骨髓间充质干细胞标记后核抗BrdU染色阳性,随着标记浓度的升高和标记时间的延长,BrdU阳性率逐渐增高,终浓度10μmol/LBrdU标记72h后阳性率达90%以上,且连续传9代均可检测到BrdU阳性细胞。第3代骨髓间充质干细胞90%处于G0/G1期,BrdU标记后88.62%处于G0/G1期,标记前后细胞生长周期无明显变化。结论:通过形态学特征、表面标记和多向分化潜能可以鉴定体外分离培养的细胞为成人骨髓间充质干细胞;BrdU标记可用于成人骨髓间充质干细胞移植入体内后存活、生长和分化的动态示踪观察;BrdU最佳标记浓度和时间分别为10μmol/L和72h。

BrdU掺入与T细胞的活化和细胞因子表达的关系

目的:探讨利用流式细胞术(FCM)检测细胞增殖(BrdU掺入)与T细胞的活化及细胞因子表达的关系。方法:正常人PBMC经PMA+Ionomycin刺激不同时间,在培养结束前1 h加入BrdU,利用抗BrdU以及多种抗细胞表面和抗细胞因子抗体标记,FCM检测。结果:体外刺激PBMC 48 h后,可见T细胞有BrdU掺入,但随着时间的延长,掺入率没有明显增加。对比分析BrdU掺入与活化分子表达的关系表明,CD69在刺激后8 h达高峰,而CD25则需要24 h后达到高峰。另外,BrdU掺入与细胞因子表达没有明显关系,当PBMC刺激后8 h,即有大量IFN-γ的表达,而当培养时间延长到24、48和72 h后,IFN-γ的表达没有明显改变。OKT3+antiCD28刺激T细胞后BrdU的阳性率高于PMA+Ionomycin刺激的T细胞,CD8+T细胞掺入率高于CD4+T细胞。结论:利用FCM检测BrdU+细胞可以用于评价T细胞的增殖反应,但在多克隆刺激的条件下,只有少数细胞发生增殖,并且BrdU掺入率受刺激剂种类和时间的影响,BrdU掺入与活化分子和细胞因子的表达均没有明显关系。

BrdU诱导大熊猫染色体脆性位点的研究

以培养的大熊猫外周血淋巴细胞为实验材料，研究了ＢｒｄＵ所诱导的大熊猫染色体脆性位点．结合显带技术，初步确定了脆性位点在染色体上的分布及其出现频率等．不同的脆性位点，其表达频率会出现显著差异．其中，Ｎｏ．２染色体着丝粒处的脆性位点对ＢｒｄＵ极为敏感，表达频率高达４０％．此外还就ＢｒｄＵ诱导脆性位点的机理进行了初步的探讨．

用BrdU标记技术观察大鼠脊髓上胸段灰质细胞的分化发育

目的 观察脊髓灰质细胞的分化发育 ,寻找脊髓移植时胎鼠脊髓取材的最佳时间。 方法 用 5 -溴 -2 -脱氧尿嘧啶 (Brd U)标记 DNA,ABC免疫细胞化学方法观察大鼠上胸段脊髓灰质细胞的增殖分化情况。 结果孕鼠于 E10 d腹腔注射 Brd U,胎鼠脊髓上胸段 Brd U免疫反应神经元主要集中在脊髓后角 ,脊髓侧角的 Brd U免疫反应神经元较少 ,前角仅有少量的 Brd U免疫反应神经元 ;孕鼠于 E11d腹腔注射 Brd U,胎鼠脊髓上胸段后角 Br-d U免疫反应神经元较 E10 d减少 ,侧角和前角 Brd U免疫反应神经元增多 ;孕鼠于 E12 d腹腔注射 Brd U,胎鼠脊髓上胸段 Brd U免疫反应神经元主要集中于前角和侧角 ,而后角仅有少量的 Brd U免疫反应神经元 ;孕鼠于 E13d、E14d腹腔注射 Brd U,胎鼠脊髓上胸段未见 Brd U免疫反应神经元。 结论 Brd U标记技术能较好的标记脊髓灰质细胞 ,胎鼠脊髓进行 Brd U标记的最佳时间应选择 E12 d,已标记胎鼠脊髓的最佳移植取材时间为

BrdU体外示踪大鼠骨髓间充质干细胞的成骨分化

背景:目前还未找到一个理想的标记性分子用来鉴定骨髓间充质干细胞,因此也就不能保证骨髓间充质干细胞的同质性。目的:以BrdU体外示踪标记验证大鼠骨髓间充质干细胞成骨诱导后的分化潜能。设计、时间及地点:细胞学体外观察,于2008-01/10在山西医科大学完成。材料:4周龄Wistar大鼠由山西医科大学实验动物中心提供。方法:密度梯度离心+贴壁培养法体外分离培养大鼠骨髓间充质干细胞,达80%融合时胰蛋白酶消化传代扩增。取5×1010L-1个骨髓间充质干细胞接种于25mm培养皿,加入含地塞米松、β-磷酸甘油、维生素C和体积分数为10%胎牛血清的L-DMDM培养基进行成骨诱导。取第3代骨髓间充质干细胞,加入终浓度为10μmol/LBrdU进行体外示踪,200倍荧光显微镜下随机选取10个视野,通过计数阳性细胞与非阳性细胞数得到BrdU标记率。主要观察指标:倒置显微镜下观察细胞形态,流式细胞仪检测细胞表面抗原,观察诱导后成骨分化潜能,体外BrdU标记率。结果:分离纯化的骨髓间充质干细胞呈均一的成纤维细胞样,贴壁生长,以长梭形为主,传至第3代呈明显的同向性改变,漩涡状盘旋排列,细胞存活率均大于95%,至第7代仍未见细胞生长减缓现象;CD44,CD71,CD105均呈阳性表达,CD45呈阴性表达;成骨诱导后Vonkossa染色可见骨髓间充质干细胞中有黑色颗粒沉积;BrdU标记率>90%。结论:密度梯度离心结合贴壁培养法能有效分离纯化大鼠骨髓间充质干细胞,可在体外长期培养,并具有成骨分化潜能;BrdU可成功标记骨髓间充质干细胞,是安全、有效、便捷的体外示踪方法。

EdU与BrdU在检测细胞增殖中的特点及应用进展

细胞增殖是细胞在周期调控因子的作用下,通过DNA复制、RNA转录和蛋白质合成等一系列复杂反应而进行的分裂过程,是生物体生长、发育、繁殖和遗传的基础[1]。细胞增殖检测广泛应用于分子生物学、免疫学、肿瘤生物学、药理学等研究领域,是评价细胞代谢、生理和病理状况的重要方法[2]。目前,常用的方法包括胸腺嘧啶核苷渗入法、MTT检测法、羟基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺脂（CFSE）检测法等。

BrdU标记大鼠骨髓间充质干细胞增殖与成骨能力的变化

背景:BrdU标记是一种标记率高、标记简便的标记物,但其毒性报道不一。目的:观察BrdU标记对SD大鼠骨髓间充质干细胞增殖与成骨能力的影响。方法:直接贴壁法分离培养大鼠骨髓间充质干细胞,0.2%Brdu标记后检测其增殖能力、克隆形成能力;经成骨诱导液诱导培养3周后,利用茜素红染色,荧光免疫组织化学和RT-PCR观测标记前后骨髓间充质干细胞成骨能力的变化情况。结果与结论:Brdu标记后骨髓间充质干细胞克隆形成能力明显减弱,在克隆个数和面积上均小于正常对照组(P<0.05);在增殖能力方面,BrdU标记后第4天开始进入对数增长期时增殖较慢,高峰较低(P<0.05);在成骨能力方面,经成骨诱导后BrdU标记组与正常对照组的骨髓间充质干细胞均表达骨钙素、Ⅰ型胶原,并且都有明显的钙结节形成,RT-PCR检测显示标记前后骨髓间充质干细胞在骨钙素基因的表达方面差异无显著性意义(P>0.05)。提示BrdU标记抑制骨髓间充质干细胞的克隆增殖形成能力,但不会降低其成骨分化能力,可以广泛应用于骨髓间充质干细胞作为种子细胞干细胞研究的示踪剂。

BrdU标记在大鼠生精细胞体外培养中的应用

目的探讨应用5-溴-2-脱氧尿苷(5-bromo-2-deoxy-uridine,BrdU)标记检测大鼠生精细胞体外的分化、发育情况。方法采用BrdU体内标记生精细胞的DNA,免疫细胞化学法跟踪观察大鼠生精细胞在体外培养中的分化、发育情况。结果培养前在体内标记BrdU的细胞为初级精母细胞,经培养后在BrdU标记的细胞中出现早期精子细胞。结论大鼠生精细胞体外培养过程中,应用BrdU标记能检测生精细胞的分化、发育情况。

应用缓释BrdU检测前腭缝成骨细胞的增殖活性

目的:配制缓释BrdU,用于检测前腭缝牵张成骨过程中成骨细胞的增殖和分化,探讨前腭缝牵张成骨的机制。方法:用泊洛沙姆温敏凝胶配制缓释BrdU,大鼠皮下注射后不同时间点采取血样,高效液相色谱法测定BrdU血药浓度,并与腹腔注射BrdU溶液进行比较。选取35天龄雄性SD大鼠40只,随机分为实验组和对照组,实验组安放扩大簧牵张前腭缝。2组动物于24h后随机皮下注射BrdU温敏凝胶1次或腹腔注射BrdU溶液1次。所有动物分别于48h和96h处死(n=5),免疫组化染色检测细胞的增殖和迁移。结果:皮下注射BrdU温敏凝胶6h后,血清中仍可检测出1.21μg/mL BrdU,免疫组化染色可见大鼠前腭缝有BrdU阳性的增殖细胞。腹腔注射BrdU溶液3h后,血清中仅检测到0.17μg/mL BrdU,免疫组化染色未见BrdU阳性细胞。前腭缝牵张48h后,骨缝边缘可见大量BrdU阳性成骨细胞;96h后可见部分BrdU阳性细胞包埋于骨缝边缘的新生骨基质中。结论:BrdU温敏凝胶能起到良好的缓释效果,为体内标记成骨细胞提供了一种简便易行的方法。牵张力作用于前腭缝后,促进骨缝边缘的间充质细胞增殖,这些细胞分化为成骨细胞并分泌骨基质,从而促进新骨形成。

BrdU标记检测大鼠垂体前叶细胞的增殖功能

目的:为了观察大鼠垂体前叶细胞中各类激素细胞的增殖水平,建立一种快速、准确、灵敏、无同位素污染的检测垂体前叶细胞增殖的方法。方法:应用原代培养大鼠垂体前叶细胞,加入5-溴-2-脱氧尿嘧啶(BrdU)标记细胞增殖,用抗BrdU抗体进行免疫细胞化学染色,观察大鼠垂体前叶细胞中各类激素细胞增殖能力。结果:大鼠垂体前叶细胞可见Br-dU阳性标记内分泌细胞,其细胞核内可见棕褐色阳性颗粒,核浆比例增大,呈颗粒状,提示处于细胞增殖期。免疫细胞双重染色表明,体外培养垂体前叶的生长激素细胞、催乳素细胞、促肾上腺皮质激素细胞均具有一定的增殖能力。结论:BrdU标记是一种有效的标记垂体前叶细胞增殖的方法,为探究大鼠垂体前叶细胞中各类激素细胞增殖能力提供了理论基础。

BrdU抗原及抗体的制备

溴脱氧尿嘧啶核苷(ｂｒｏｍｏｄｅｏｘｙｕｒｉｄｉｎｅ,ＢｒｄＵ)可替代ＤＮＡ前体胸腺嘧啶核苷竞争掺入Ｓ期细胞ＤＮＡ,取代3ＨＴｄＲ的应用,避免放射性污染,且检测方便省时。核苷属小分子半抗原,不能刺激机体产生抗体,需与大分子载体连接成完全抗原才引起宿主有效的免?..

侧脑室注射NMDA受体激动剂后精神分裂症小鼠海马齿状回内NR1和BrdU的改变

目的:探讨精神分裂症(schizophrenia,SP)小鼠侧脑室注射N-甲基-D-天门冬氨酸(NMDA)受体激动剂后,海马齿状回(dentate gyrus,DG)颗粒细胞层NR1和5-溴脱氧尿嘧啶核苷(BrdU)阳性细胞数量的改变。方法:选择健康6周龄雄性C57小鼠,地卓西平马来酸盐(MK-801)慢性给药制备精神分裂症动物模型,实验分为NMDA组、生理盐水组、SP组和空白对照组共四组,NMDA组侧脑室注射NMDA受体激动剂。BrdU标记后行免疫荧光染色,激光共聚焦显微镜下观察和计数DG颗粒细胞层NR1和BrdU阳性细胞的表达和数量变化。结果:(1)NR1阳性细胞数在NMDA组、空白对照组、SP组和生理盐水组分别为16.1±2.08,14.5±2.17,19.4±4.65,19.5±4.33,经比较,NMDA组和空白对照组NR1阳性细胞的数量明显少于SP组(P<0.05),但NMDA组与空白对照组相比无明显差异(P>0.05),SP组与生理盐水组相比也无明显差异(P>0.05)。(2)BrdU阳性细胞数在NMDA组、空白对照组、SP组和生理盐水组分别为5.2±2.53、5.3±0.82、3.4±1.58、3.5±1.35,经比较,NMDA组和空白对照组分别多于SP组(P<0.05),和生理盐水组(P<0.05);但NMDA组较空白对照组无明显差异(P>0.05),SP组较生理盐水组亦无明显差异(P>0.05)。结论:SP小鼠侧脑室注射NMDA受体激动剂后,可引起DG颗粒层NR1阳性细胞数减少和BrdU阳性神经细胞数的增多。

用猪AMI模型研究荧光染料CFSE和Brdu作为移植细胞标记物的实用性

目的研究荧光染料CFSE和Brdu作为体内细胞移植标记物的实用性。方法构建猪急性心肌梗死(AMI)模型。用CFSE和Brdu对骨髓单个核细胞进行双标记,经冠状动脉回输至MI区。4周后,利用激光共聚焦显微镜和免疫组织化学法分别观察CFSE和Brdu的定位和标记情况。结果细胞移植4周后,发现Brdu阳性细胞多位于心肌疤痕形成区且MI区的新生血管内壁也出现阳性染色。在MI区可见CFSE标记的带绿色荧光的细胞,但背景色较高。结论在动物实验中,CFSE和Br-du均可作为移植细胞标记物,Brdu的标记效果优于CFSE,适于同时进行形态学和组织学研究。