甾短杆菌胆固醇氧化酶基因在大肠杆菌中的表达

为了实现胆固醇氧化酶在大肠杆菌中的表达,将甾短杆菌Brevibacteriumsp.DGCDC-82胆固醇氧化酶基因用PCR的方法去掉信号肽序列,连接到质粒pTrc99a,通过筛选得到了表达胆固醇氧化酶的重组菌JM109/pTrc99a-COD。经IPTG诱导后表达出相对分子质量约为5.5×104的蛋白质。分别考察了诱导温度、时间、IPTG浓度等因素对重组菌表达的胆固醇氧化酶的影响。在优化条件下,该胆固醇氧化酶的酶活可以达到700 U/L。酶学特性分析表明其反应的最适pH为7.5,最适温度为40℃。

胆固醇氧化酶基因的克隆及在E.coli中的表达

根据NCBI中报道的BrevibacteriumsterolicumATCC21387胆固醇氧化酶基因序列,采用PCR方法以Brevibacteriumsp.DGCDC-82的基因组为模板,扩增得到了编码胆固醇氧化酶的基因,该基因与来源于BrevibacteriumsterolicumATCC21387的胆固醇氧化酶基因(choB)同源性为98%。将得到的基因定向克隆到pET28a载体中,转化至含有编码argU和proL基因的大肠杆菌BL21-CodonPlus(DE3)-RP中表达。经过IPTG诱导后,经SDS-PAGE检测在约55kD处有一蛋白表达条带,目的蛋白表达量约占总蛋白的16%,经测定酶活为340U/L。

信号肽对短杆菌胆固醇氧化酶基因在大肠杆菌中表达的影响

从Brevibacterium sp.DGCDC-82染色体DNA中扩增出含信号肽序列的胆固醇氧化酶结构基因,插入大肠杆菌表达载体pET28a(+)中,构建重组质粒pET28a-COD(s+)。以pET28a-COD(s+)为底物,扩增出不合信号肽的胆固醇氧化酶结构基因,构建成重组质粒pET28a-COD(s-)。两种重组载体转化大肠杆菌BL21(DE3)通过IPTG诱导均获得活性表达,SDS-PAGE分析,目的产物表达量都占到了细胞总蛋白的50%以上,Brevibacterium sp.DGCDC-82胆固醇氧化酶的信号肽对重组酶的空间构象和表达量并没有太大的影响。