真菌基因组DNA的提取和通用PCR检测方法的建立

目的改良真菌基因组DNA的提取方法,建立真菌通用聚合酶链反应(PCR),为目前临床真菌感染的早期诊断、预防和治疗提供有效工具。方法参考前人报道的多种真菌基因组DNA的提取方法,作改良以确立本研究中所采纳的手段,并应用真菌核糖体DNA(rDNA)通用引物,以实验室保存的标准菌株及临床分离菌株来建立临床真菌感染检测用通用PCR。结果白念珠菌和烟曲霉在75℃温度下分别作用60和80 min可以完全被灭活。经目前多种破壁方法的探讨,发现对于白念珠菌(单细胞真菌)选用酶消化法,破壁效率高达98.29%,而烟曲霉(多细胞真菌)则需要酶消化法与打击器振荡法联合应用,其破壁率也可达66.68%,进一步用酚氯仿法抽提其基因组DNA,能够获得相对纯度高且有一定得量。当选择真菌rDNA ITS2区间的一对通用引物,通过PCR反应体系的优化,使得本研究中建立的通用PCR,对于白念珠菌和烟曲霉的检测下限分别为5个和9.7个,其PCR产物测序结果与数据库比对完全一致,同时选择临床分离的或实验室保存的其他真菌、细菌和病毒株进行验证,该方法仅针对真菌群,结合测序分析可以实现种属水平的鉴定。结论改良真菌基因组DNA提取后所建立的针对真菌rDNA的通用PCR敏感且特异,适宜实验室操作。

植物病原真菌分子诊断技术研究进展

对植物真菌病害分子诊断技术的种类、特点、应用情况、存在的问题及未来发展趋势进行了综述,旨在建立一种快捷准确的植物真菌病害分子诊断技术,以最大限度地减少农业损失。

通用引物PCR方法快速检测兔眼真菌性角膜溃疡

目的 应用真菌通用引物聚合酶链反应PCR ,对兔眼真菌性角膜溃疡进行快速检测。方法 建立兔眼烟曲霉菌、白色念珠菌和镰刀菌真菌性角膜溃疡的模型 ,根据国外文献报道的基因序列选出真菌通用引物 ,一对寡核苷酸引物B2F(5’ ACTTTCGTAG GATAG 3’)和引物B4R(5’ TGATCGTCTTCGATAAATA 3’)进行聚合酶链反应。结果 在 6 87bp处出现DNA扩增带者为阳性。动物造型 3d后 ,通过PCR技术、常规刮片和培养 3种实验室手段诊断为真菌性角膜炎的敏感性分别为 90 .0 %、33.3%和 4 0 .0 % ;5d后 ,PCR技术、常规刮片和培养的敏感性分别为 96 .6 %、5 0 .0 %和 6 0 .0 % .结论 通用引物PCR技术检测兔眼真菌性角膜溃疡快速、敏感、可靠。

我国西南地区主要谷物表面污染真菌的分离与分子鉴定

目的了解我国西南地区2014-2015年产主要谷物污染状况,探索谷物表面污染真菌的快速鉴定方法。方法利用孟加拉红培养基进行谷物表面真菌的分离与纯化。选用扩增真菌18S序列的通用引物ITS1和ITS4,通过PCR扩增和序列分析进行菌种鉴定。结果从157份谷物样品中分离得到277株真菌,利用分子生物学鉴定方法成功鉴定,污染率为42.0%,其中小麦主要侵染真菌为枝孢菌属、链孢霉属和小光腔菌属,玉米、大米主要侵染真菌为链孢霉属、曲霉菌属和青霉菌属。结论我国西南地区谷物样品的污染现象比较普遍,产毒菌株污染较为严重,存在潜在风险。选用的引物通用性较好,可用于谷物表面污染真菌的鉴定。

聚合酶链反应诊断新型隐球菌脑膜脑炎50例

目的 探讨聚合酶链反应 (PCR)在新型隐球菌脑膜脑炎快速诊断的临床价值 .方法 应用聚合酶链反应检测 5 0例临床脑脊液标本中的新型隐球菌 ,同时用直接涂片墨汁复染、真菌培养进行对比检测 .结果 在 5 0例患者临床脑脊液标本中 ,PCR检测阳性 11例 ;直接涂片墨汁复染阳性 7例阳性 ;真菌培养阳性 9例 .结论 用 PCR方法具有简便、快速、特异、敏感的特点 ,从脑脊液标本中直接检测新型隐球菌 ,提供病原学诊断依据 。

系统性红斑狼疮合并深部真菌感染多重荧光定量PCR检测研究

目的建立系统性红斑狼疮(SLE)合并白念珠菌和黄曲霉感染的多重荧光定量PCR检测技术,为其诊断提供快速、敏感、特异的方法。方法通过ATCC公布的白念珠菌及黄曲霉的基因序列,应用分子生物学软件设计两对引物和Taqman探针,通过检测狼疮患者合并白念珠菌及黄曲霉等深部真菌感染,怀疑深部真菌感染样品各20例,以及非白念珠菌及非黄曲霉微生物样品20例,以评价该法阳性率、敏感性、特异性。结果多重荧光定量PCR检测SLE合并白念珠菌和黄曲霉感染的阳性率及特异性均为100%;而该法和真菌培养法敏感性分别为75.00%和40.00%,且有统计学差异(P<0.05)。结论基于Taqman探针技术的实时荧光PCR检测体系,可同时检测SLE患者合并白念珠菌和黄曲霉深部真菌感染,具有快速、灵敏度高、特异性强、可定量等优点。

反转录PCR在真菌性角膜溃疡快速诊断中的价值

目的:探讨聚合酶链反应(RT-PCR)快速检测在真菌性角膜溃疡诊断中的价值。方法:以条件致病性真菌18srRNA基因保守区的一对寡核苷酸序列为通用引物,对临床拟诊为真菌性角膜溃疡的42例标本进行RT-PCR检测,并与培养方法进行对比。结果:在400bp处出现DNA扩增带者为阳性。26份临床标本的真菌培养阳性,阳性率为61.9%,而经RT-PCR扩增阳性率为73.8%,PCR扩增准确性为83.8%,敏感性为100.0%,特异性为33.3%。结论:真菌通用引物进行PCR反应检测真菌性角膜溃疡速度快、阳性率高,有助于真菌性角膜溃疡的快速诊断。

PCR检测在真菌性角膜溃疡中的诊断价值

目的探讨聚合酶链反应(PCR)快速检测在真菌性角膜溃疡诊断中的价值。方法以源于医学条件致病性真菌18srRNA基因保守区的一对寡核苷酸序列为通用引物,对临床拟诊为真菌性角膜溃疡的36例标本进行PCR检测,并与培养方法进行对比。结果在400bp处出现DNA扩增带者为阳性。36份临床标本的真菌培养阳性率为58.3%,而经PCR扩增阳性率为86.1%,PCR扩增准确性为72.2%,敏感性为100.0%,特异性为33.3%。结论真菌通用引物进行PCR反应检测真菌性角膜溃疡速度快、阳性率高,有助于真菌性角膜溃疡的快速诊断。

聚合酶链反应快速诊断真菌性角膜炎

目的 探讨聚合酶链反应 (PCR)技术快速诊断真菌性角膜炎的价值。方法 建立常见致病性真菌菌株的PCR检测方法 ,对兔茄病镰刀菌角膜炎模型研究并应用于临床检测 33例角膜刮片标本 ,结果与涂片镜检和真菌培养做比较。结果 PCR 5h可检测出标本中微量真菌 ,细菌、HSV、人和兔正常角膜组织均为阴性。动物模型和临床标本PCR敏感性分别为 84 .4 %和 81.8% ,均明显高于涂片镜检和真菌培养 (P <0 .0 5 )。结论 PCR速度快、敏感性和特异性高 ,有助于真菌性角膜炎的快速明确诊断。

真菌四重PCR体系的建立及其临床应用

目的建立多重PCR体系并探讨其用于深部真菌感染诊断的可行性。方法用真菌通用引物内转录间区(ITS)联合曲霉属、镰刀菌属、毛孢子菌属、白念珠菌、新生隐球菌特异性引物建立多重PCR体系,用单重和四重PCR检测模拟体液和30例可疑深部真菌感染患者临床标本中的真菌。结果ITS可与5对属或种特异性引物任意组合(二重PCR),四重PCR组合为ITS+毛孢子菌属+白念珠菌+新生隐球菌。30例临床标本中,真菌培养、PCR检测的阳性率分别为26.67%和43.33%,两种方法的检出率差异无统计学意义(P>0.05)。结论单重和四重PCR敏感性高、稳定性好、操作简单、耗时短,可为深部真菌感染的早期诊断提供病原学依据。

建立FQ-PCR定量体系检测新型隐球菌CAP10 mRNA

目的建立荧光定量PCR(FQ-PCR)技术定量检测新型隐球菌(CN)的荚膜相关蛋白10(CAP10)基因mRNA,为新型隐球菌的诊断、预后及疗效判断提供依据。方法用逆转录PCR的方法从CN标准株(ATCC34874)中扩增得到CAP10,构建重组质粒标准品pGEMT-Easy-CAP10,以倍比稀释的标准品制备标准曲线。设计引物和探针,建立FQ-PCR反应体系并对其重复性、特异性和线性范围进行评价。结果成功构建了重组质粒标准品pGEMT-Easy-CAP10,并用倍比稀释的标准品制备了标准曲线Y=-3.11X+38.84。批内重复性试验CV值为0.31%,批间重复性试验CV值为2.73%。FQ-PCR体系能特异扩增新型隐球菌,特异性好,该体系的线性范围为101copies/μL～108copies/μL。结论成功建立CN的CAP10 mRNA的定量检测方法;该方法重复性好,特异性强。

香菇菌丝体杆形病毒的RT-PCR检测及鉴定

根据GenBank公布的香菇杆形病毒部分基因组序列(登录号:GQ372842)设计引物,建立了香菇菌丝体病毒的反转录-聚合酶链式反应(reverse transcription polymerase chain reaction,RT-PCR)检测方法,浙江省的36个香菇栽培菌株的菌丝体经鉴定,菌株988、939、937、9319、868、66和WL-3的菌丝体不含杆形病毒;菌株灵的菌丝体可能含有杆形病毒;另外28个香菇菌株的菌丝体可能感染杆形病毒。

卡地腐霉Pr1蛋白酶miniDNA文库的构建及基因片段的克隆

目的: 在本实验室已克隆得到的灭蚊真菌卡地腐霉类枯草杆菌蛋白酶基因的部分序列的基础上,继续分离该基因的全基因组序列。方法:采用构建卡地腐霉mini基因组文库的方法,首先利用已知序列设计引物,克隆得到该蛋白酶基因的部分基因组序列;然后采用限制性内切酶XhoⅠ消化卡地腐霉基因组DNA,同时用该内切酶消化质粒pBluescriptSK( -),经去磷酸化后,将基因组酶切产物克隆到载体上并转化到大肠杆菌JM109中,构建mini基因组文库。利用载体上的通用引物和根据已知序列设计的引物,进行嵌套式PCR。结果:获得一780bp的PCR产物,经克隆、测序和分析为卡地腐霉类枯草杆菌蛋白酶基因已知序列一端301bp未知序列。结论:这种方法操作简便,实验周期短,能够特异地扩增与已知位点相邻的基因组DNA。

贵阳腐霉类枯草菌素蛋白酶基因的原核表达

目的:实现贵阳腐霉(Pythium guiyangense Su)类枯草菌素蛋白酶(subtilisin-like protease,Pr1)基因在大肠杆菌中的活性表达,验证已获得的基因序列(YP1977)是否属于subtilisin-like protease基因家族成员。方法:(1)提取贵阳腐霉总RNA,以已获得的序列(YP1977)为模版设计引物,利用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术扩增Pr1基因ORF片段;(2)构建含有Pr1基因ORF序列、绿色荧光蛋白基因ORF序列的重组质粒pTWIN1-Pr1-EGFP,转化表达菌株E.coliER2566,IPTG诱导菌株表达Pr1蛋白酶。结果:成功构建含有Pr1基因ORF序列、绿色荧光蛋白ORF序列的重组质粒pTWIN1-Pr1-EGFP,实现了Pr1基因在大肠杆菌中的活性表达。结论:证明已获得的DNA序列是贵阳腐霉的一个Pr1基因的编码区。

脑脊液PCR检测对中枢神经系统侵袭性曲霉菌感染的诊断价值——系统评价和双变量Meta分析

目的系统评价脑脊液多聚酶链反应(PCR)对中枢神经系统侵袭性曲霉菌感染的诊断价值。方法计算机检索PubMed、The Cochrane Library、EMbase、CNKI、WanFang Data、CBM和VIP,查找评估PCR对中枢神经系统侵袭性曲霉菌感染诊断价值的相关研究,检索时限均为从建库至2015年1月10日。由两位评价者按照纳入与排除标准独立筛选文献、提取资料并评价纳入研究的方法学质量后,采用Stata 12.0软件统计并Meta分析,评估异质性及发表偏倚。结果最终纳入8个研究,共130例病人,确诊/可信病人数为27例(20.8%)。针对3篇病例对照及1篇队列研究的Meta分析结果显示:敏感度(Sen)、特异度(Spe)、阳性似然比(+LR)、阴性似然比(-LR)、诊断比值比(DOR)、ROC曲线下面积(AUC)分别为0.984[95%CI(0.796,0.992)]、0.930[95%CI(0.837,0.971)]、14.09[95%CI(5.87,33.82)]、0.016[95%CI(0.001,0.843)]、847[95%CI(16,4536)]、0.99[95%CI(0.97,0.99)]。但有一定的异质性(I^2=37%)和发表偏倚(P=0.095)存在。脑脊液PCR阳性率显著高于脑脊液GM检测(P=0.018)和血PCR检测(P=0.02)。结论脑脊液PCR对中枢神经系统侵袭性曲霉菌感染有较高的诊断价值。但PCR检测方法学上存在异质性,发表偏倚可能高估PCR方法的诊断价值,上述结论仍需谨慎看待。

早产儿侵袭性真菌感染6例临床分析

目的 分析早产儿侵袭性真菌感染的临床特点、检验方法、感染部位、病原菌及预后,为早期诊断、减少死亡提供参考依据。方法 对2012年1月-2013年12月我院NICU确诊的6例侵袭性真菌感染病例进行回顾性临床资料分析。结果 6例患儿均为白色念珠菌感染。其中2例为肺部真菌感染,2例为真菌性败血症。另2例为双胎儿,母羊水培养报告为白色念珠菌,考虑感染部位尚不明确的深部真菌感染。临床表现无特异性,可出现喂养不耐受、青紫、呼吸暂停、反应差、黄疸等。6例患儿中5例给予抗真菌治疗,其中治愈4例,好转1例,另1例未予抗真菌治疗的患儿因家长放弃出院后死亡。结论 早产儿侵袭性真菌感染临床表现无特异性,病情突然变化应警惕真菌感染,白色念珠菌多见。真菌培养为诊断的金标准,PCR检测可用于侵袭性真菌感染的早期诊断中,加强产儿科协作,有助于早期明确诊断。

利用RAPD-STS和实时定量PCR鉴别菠菜枯萎病病原菌(Fusarium oxysporum f.sp.spinaci-ae)(英文)

菠菜枯萎病是由致病性镰刀菌(F.o.f.sp.spinaciae)引起的,是菠菜生产中的重要病害之一。利用常规方法鉴定菠菜枯萎病病原菌需耗费大量时间,并且很难得到正确的结论。随机扩增多态性DNA序列标签(Randomly amplifiedpolymorphic DNA-sequence tagged sites,RAPD-STS)为病原菌鉴定提供了一种有效方法。本研究通过对供试菌株的RAPD分析,克隆出了1个菠菜枯萎病病原菌的特异片段(GenBank登录号:AY337463)。根据测序结果设计了1对菠菜枯萎病病原菌的特异引物,并利用常规PCR和实时定量PCR(real-time PCR)2种方法对病原菌进行了鉴定,并对2种方法的敏感性进行了比较。结果表明,2种PCR方法都可以鉴定菠菜枯萎病病原菌(F.o.f.sp.spinaciae),但二者对病原菌DNA敏感程度不同,常规PCR检测的最低DNA量100 pg,而实时定量PCR检测的最低DNA量是1 pg。同时,实时定量PCR还可以对病原菌DNA进行定量分析,并依此估算病原菌的数量。该方法可用于菠菜枯萎病病原菌的快速鉴定和病因诊断。

出芽短梗霉致肺部真菌感染1例并文献回顾

出芽短梗霉是一种在自然界中普遍存在的暗色酵母样真菌,作为一种条件致病菌,在正常免疫力患者中感染极其罕见。本文报告一例免疫功能正常的年轻女性感染出芽短梗霉病例,该例患者免疫功能正常,临床表现不典型,行肺泡灌洗液宏基因组二代测序(mNGS)检查见出芽短梗霉生长,行伏立康唑抗真菌治疗后明显好转。通过文献回顾,发现全球报道亦少见,共31例患者,其中男性20例,女性11例,年龄4月龄~79岁,2例患者免疫功能正常,无感染高危因素,余有基础疾病、继发性免疫抑制、外伤、移植等病史。临床表现无特异性,主要与受累系统相关,经抗真菌治疗好转及痊愈24例,7例死亡。近来年真菌感染越来越常见,出芽短梗霉所致真菌感染可累及全身各个部位,无免疫缺陷机体亦可能感染。通过mNGS检查可有效检测病原菌,从而及时诊断,缩短病程,有效治疗。

连续式白腐真菌膜生物反应器处理染料废水：微生物群落结构及其与脱色效率的关系

通过PCR-DGGE(变性浓度梯度凝胶电泳)分析评价了连续运行100天的白腐真菌膜生物反应器中群落结构的变化,并研究了群落结构与染料脱色效率之间的耦联关系,且通过多维尺度(MDS)方法对DGGE电泳图谱进行分析,以二维图形向量的方式显示。结果表明,通过对系统内优势菌种的18S rDNA序列进行测定,并通过NCBI(美国国立生物技术信息中心)基因库比对确定的菌种Phanerochaete chrysosporium(P.chrysosporium)在运行期间始终是微生物群落的优势种,随着系统运行时间的延长,其优势愈加明显,但反应器中微生物群落结构Shannon-Wiener多样性指数却逐渐降低,由起始阶段的1.92降至最终的0.92。对DGGE条带进行MDS分析得知,反应器在运行阶段基本稳定维持处在一个区域,表明其微生物群落结构在运行期间较为稳定,且该反应器对染料废水始终具有良好的脱色效果,平均脱色率为82.5%,最高时可达93.2%。

聚合酶链反应-变性梯度凝胶电泳分析在毒死蜱胁迫下土壤真菌群落结构演替

为评价毒死蜱施用后对土壤真菌群落结构的影响,将农田土壤用终质量分数5mg/kg毒死蜱处理,同时以不施用毒死蜱为对照,定期采集土样进行毒死蜱残留测定并提取土壤DNA,采用基于染色体内转录间隔区(internaltranscribed spacers,ITS)ITS1f-GC/ITS2和28SrDNA U1-GC/U2引物对进行聚合酶链反应-变性梯度凝胶电泳,获得的指纹图谱利用Quantity One软件进行数字化分析,计算样品的多样性指数(H),并用Matlab软件进行主成分分析.ITS1f-GC/ITS2和U1-GC/U2扩增区域分析结果表明,毒死蜱施用后第7～60天内土壤真菌群落结构与对照相比发生很大改变,且毒死蜱处理样品真菌群落结构保持基本稳定,多样性指数明显提高;主成分分析显示,毒死蜱处理样品与对照明显分在2个不同的区域,充分表明毒死蜱对土壤真菌群落结构影响迅速且持久.