天蚕素AD和蛙Buforin Ⅱ融合蛋白在大肠杆菌中的表达

本试验采用改良二步全基因合成法人工合成了含大肠杆菌偏爱密码子的天蚕素AD和蛙BuforinⅡ成熟片段的融合基因,并克隆至pMD18-T中,经测序确认正确后,与pET-Trx连接,构建了表达载体pET-Trx-CAD-BuforinⅡ,并在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达。表达产物占菌体总蛋白的35%,经羟胺裂解后对测试菌具有较好的杀菌效果,为进一步的开发与应用打下了基础。

日粮添加抗菌肽buforin Ⅱ对病毒性腹泻断奶仔猪小肠黏膜屏障和TLR-2信号途径的影响

将15头体质量为(5.42±0.72)kg的21d病毒性腹泻断奶仔猪随机分为3组,对照组饲喂基础日粮,试验组分别在基础日粮中添加100mg/kg新霉素和1.0mg/kg抗菌肽buforinⅡ,饲养期10d。每个处理5个重复,每个重复1头仔猪。结果显示,与对照组和新霉素组相比,日粮添加抗菌肽buforinⅡ能显著降低病毒性腹泻断奶仔猪腹泻指数,显著降低血清IgA、IgM和IgG的浓度、空肠黏膜sIgA的浓度(P<0.05);显著下调病毒性腹泻断奶仔猪空肠和回肠黏膜TLR-2、PKR和eIF-5A mRNA相对表达丰度(P<0.05);显著提高病毒性腹泻断奶仔猪空肠和回肠绒毛高度、绒毛高度/隐窝深度、GSH-Px、NOS、SOD、GR和T-AOC浓度(P<0.05)以及空肠黏膜occludin蛋白水平(P<0.05)。结果表明,日粮抗菌肽buforinⅡ能减轻病毒对断奶仔猪空肠黏膜屏障功能的损伤作用。

抗菌肽BuforinⅡ衍生物对金黄色葡萄球菌细胞膜作用机制的研究

为研究抗菌肽BuforinⅡ的衍生物BF2-A/B对金黄色葡萄球菌细胞膜的作用机制,用流式细胞仪分析BF2-A/B对金黄色葡萄球菌细胞膜通透性的影响,以及穿膜效率,用透射电镜观察细胞膜的完整性,激光共聚焦显微镜观察抗菌肽在胞质内的积累。结果显示,BF2-A/B都不显著引起PI流入细胞质内,但BF2-B处理的细胞PI着染阳性比例高于BF2-A。BF2-A处理20min后的细胞膜依然完整,而BF2-B能使胞质内容物轻微泄漏。抗菌肽BF2-A/B都能显著穿透细胞膜,并且BF2-B的穿膜效率高于BF2-A。同时荧光共聚焦显微镜也证实抗菌肽在细胞质内的累积。研究结果说明BF2-A/B并不破坏金黄色葡萄球菌细胞膜,而是进入细胞内实施抗菌活性。BF2-B在穿透细胞膜的过程中对膜的扰动较大,导致了PI的少量流入以及细胞内容物的泄露,同时穿膜效率提高,抗菌活性更强。

Buforin Ⅱ衍生肽的分子设计、结构分析及活性研究

在Buforin Ⅱ衍生肽BF2-A的结构特征基础上,重新设计新抗菌肽BF2-X。BF2-X是将BF2-A的N-端保持不变,在第10位精氨酸上接入一个3次重复的α-螺旋序列RLLR,并将第8位上的缬氨酸用亮氨酸取代。生物信息学分析表明,与BF2-A相比,BF2-X的正电荷增加,疏水性比例提高,螺旋度增加,同时两亲性也增强。化学合成后经圆二色谱检测表明,BF2-A/X在水相中是一种无规则卷曲结构,当置于模拟细胞膜疏水环境的50%三氟乙醇中时,BF2-A/X会被诱导成α-螺旋结构,并且BF2-X的α-螺旋含量明显高于BF2-A。抑菌试验表明BF2-X对细菌以及真菌都具有广谱抗菌活性,BF2-X对细菌的抗菌活性要比BF2-A强。BF2-X的α-螺旋含量的提高可能与抗菌活性的增强有直接的关系。BF2-A/X对小鼠红血球不具有体外溶血活性。

抗菌肽buforinⅡ的研究进展

抗菌肽buforinII是由亚洲蟾蜍bufo bufo gargarizans胃组织中分离得到一种烈性抗菌肽,具有很强的抗菌活性。它的结构和多数α螺旋抗菌肽相似,但作用机制却有较大的区别。BuforinⅡ利用其特有的结构在不造成膜穿孔的情况下迅速通过细胞膜,与胞内的生物大分子核酸结合,诱发细胞死亡。本文就buforinⅡ的结构,作用机制,研究现状及其应用前景进行阐述。

抗菌肽BuforinⅡ衍生物特异性结合金黄色葡萄球菌DNA抑菌机理的研究

旨在研究抗菌肽BuforinⅡ的衍生物BF2-A/B作用于金黄色葡萄球菌基因组DNA的抑菌机制。原子力显微镜观察了BF2-A/B对金黄色葡萄球菌基因组DNA的结合作用,用凝胶阻滞试验分析了BF2-A/B结合DNA的能力,DNaseⅠ足迹试验研究衍生肽与基因组DNA结合的特异性,并考察了对细胞呼吸作用和ATP合成的影响。结果显示,BF2-A/B都能结合基因组DNA,BF2-B的结合能力比BF2-A强,并且都趋向特异性结合基因组DNA上的2个区段,其中1个是23SrRNA基因上的1段保守序列,衍生肽还影响细胞的氧化磷酸化过程,显著抑制细胞呼吸作用和ATP合成,BF2-B的抑制比BF2-A更强烈。研究结果说明BF2-A/B是通过渗透细胞膜进入细胞质,特异性结合基因组DNA上的2个区段,并抑制细胞呼吸作用和ATP合成而杀菌。BF2-B结合DNA的能力更强,抑制细胞呼吸作用和ATP合成的能力更强,因此具有更强的抑菌活性。

抗菌肽BuforinⅡ衍生物的生物活性研究

研究了抗菌肽BF2-A/B的抗菌活性及其他的生物活性。两个肽均具有很强的广谱抗菌活性,BF2-B对细菌的抑菌活性比BF2-A强,它们没有体外溶血活性。BF2-A几乎没有细胞毒性,而BF2-B在100μg/mL时,能抑制大约20%的肿瘤细胞生长。两个肽均能结合脂多糖,中和内毒素,BF2-B与脂多糖的亲和结合力比BF2-A强。BF2-A/B经胃蛋白酶和胰蛋白酶处理后,抗菌活力都略有下降,而经蛋白酶K处理一段时间后,就完全丧失了抗菌活性。

重组大肠杆菌利用乳糖自诱导系统融合表达天蚕素AD和蛙BuforinⅡ

以包含质粒pET-Trx-CAD-BuforinⅡ的大肠杆菌BL21(DE3)为研究对象,开发了一种利用乳糖自诱导方式表达天蚕素AD和蛙BuforinⅡ的表达系统。首先,在LB培养基中研究了乳糖浓度、诱导时机和诱导时间对目的蛋白表达的影响。然后,利用"分解代谢物阻遏"原理构建乳糖自诱导表达系统,以"葡萄糖+主碳源"两种碳源的依次代谢将蛋白表达过程分为两个阶段:第一阶段为菌体生长阶段,菌体利用葡萄糖生长,乳糖无法进入细胞诱导蛋白表达;第二阶段为蛋白表达阶段,葡萄糖耗尽,菌体开始利用主碳源生长;同时乳糖进入细胞诱导蛋白表达。最后,利用优选的"葡萄糖+木糖"组合自诱导表达天蚕素AD和BuforinⅡ的融合蛋白,得到的目的蛋白占全菌总蛋白含量的45.2%。

抗菌肽buforinⅡ结构及其抗菌和抗癌活性研究进展

抗生素滥用加速了细菌产生抗生素耐药性,抗菌肽作为对抗抗生素耐药细菌的潜在候选药物备受关注。buforinⅡ作为其中一种潜力分子成为目前的研究热点。buforinⅡ的结构类似于阳离子α螺旋抗菌肽,其“螺旋-脯氨酸铰链-双亲性螺旋”的独特结构在抗菌和抗癌等方面起决定性作用。通过截短、替换和拼接等策略对buforinⅡ及其同源肽进行结构改造可获得具有良好抗菌和抗癌作用的衍生肽。同时,对不同物种间buforinⅡ同源肽的对比和分析拓宽了分子改造的思路。本文综述buforinⅡ及其重要衍生肽的结构及其抗菌和抗癌活性等的最新研究进展,为新抗菌肽的挖掘和临床应用提供理论依据。

抗菌肽BuforinⅡ衍生物抑制大肠杆菌大分子合成的研究

【目的】研究抗菌肽BuforinⅡ的衍生物BF2-A/B作用大肠杆菌后对胞内生物大分子合成的影响。【方法】紫外分光光度法检测抗菌肽对细胞DNA、RNA合成能力的影响,考马斯亮蓝法检测抗菌肽对细胞总蛋白合成能力的影响,分别用邻硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷法和对硝基苯磷酸二钠法检测抗菌肽对β-半乳糖苷酶及碱性磷酸酶表达活性的影响。【结果】BF2-A/B不优先抑制DNA合成,而是优先抑制RNA和蛋白的合成。在相同浓度下,BF2-B抑制RNA合成的能力比BF2-A强,BF2-A抑制蛋白合成的能力比BF2-B强。胞内酶β-半乳糖苷酶和碱性磷酸酶的表达活性都在下降。【结论】BF2-A/B结合胞内核酸后,没有首先影响DNA的复制功能,而是优先抑制基因转录功能,主要在转译水平上抑制蛋白的合成。

抗菌肽BuforinⅡ衍生物与大肠杆菌基因组DNA的作用机制

【目的】研究抗菌肽BuforinⅡ的衍生物BF2-A/B与大肠杆菌基因组DNA的作用机制。【方法】琼脂糖电泳检测肽对DNA的断裂作用,凝胶阻滞实验研究肽与DNA的结合作用,圆二色谱考察结合肽后DNA结构的变化,荧光光谱分析肽与溴化乙锭竞争性嵌入DNA以及磷酸根对肽与DNA相互作用的影响。【结果】BF2-A/B不断裂基因组DNA而是结合DNA,使DNA双螺旋结构变得松散,削弱碱基对间的堆积作用,并取代EB,使EB-DNA复合体系荧光减弱。而PO43-的加入减弱了肽对DNA-EB荧光的淬灭作用。【结论】衍生肽与DNA的结合方式是先靠静电引力吸附到DNA磷酸基团上,随即插入双螺旋沟槽,嵌入碱基对间。BF2-B有更多的正电荷,更强的插入沟槽和嵌入碱基对的能力,使得其结合DNA的能力比BF2-A强。