猪瘟病毒C株表位突变毒株的构建及拯救

本研究旨在突变猪瘟病毒C株WH303位点,构建感染性克隆,为猪瘟病毒C株标记疫苗的研究提供候选毒株。本试验以猪瘟病毒C株为研究材料,经重叠PCR方法突变WH303位点,再分别连接至C株和C-flag株全长感染性克隆。体外转录RNA,转染PK15细胞,细胞连续传代完成病毒的拯救和增殖。结果显示,经特异性限制内切酶酶切反应验证,感染性克隆构建成功。经RT-PCR、过氧化物酶单层细胞试验检测,表明病毒成功拯救。病毒细胞传代至17代,检测到病毒,表明病毒可以稳定传代。综上,本研究成功构建了C株WH303突变感染性克隆MC和MC-flag,并成功拯救MC株,得到可以稳定传代的病毒株。

鸡胚免疫新城疫疫苗后宿主法氏囊转录组学分析

【目的】通过转录组学分析鸡胚免疫新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)TS09-C株后宿主法氏囊内免疫关键基因及信号通路分子转录差异,探究免疫后宿主法氏囊内免疫相关分子的调控反应。【方法】将60只18胚龄SPF鸡胚随机分为免疫组和对照组,30枚/组,免疫组将NDV TS09-C株通过羊膜腔接种鸡胚,剂量为103.0 EID 50/枚,注射体积为0.1 mL,对照组以同样的方法接种等体积PBS。检测免疫后不同时间点肺脏、胸腺、脾脏和法氏囊组织的病毒载量。选取病毒载量最高的法氏囊组织进行转录组学测序后,筛选免疫相关差异表达基因并分析其参与的主要功能及通路。【结果】免疫后1 d法氏囊组织中即可监测到病毒,免疫后3 d病毒载量达到最高。将免疫后3 d的法氏囊进行转录组学分析,与对照组相比,免疫组有453个基因上调、98个基因下调,其中免疫相关基因有36个上调、10个下调。免疫相关差异表达基因主要富集于自噬和细胞因子-细胞因子受体相互作用的免疫相关通路。差异表达基因蛋白互作分析显示,自噬通路中富集的BCL2与其他免疫相关基因有较多互作关系,且在B细胞活化、分化、免疫系统发育等功能注释中均有参与。【结论】本研究结果揭示了鸡胚免疫NDV TS09-C株后法氏囊内调控B细胞活化、分化的潜在靶向基因及通路,为进一步研究该毒株鸡胚免疫后B淋巴细胞调控的分子机制提供新的信息。

弯剪耦合作用下大尺寸碳纤维C型梁失效损伤模式分析

为进一步探究大尺寸碳纤维C型梁结构抗弯剪屈曲的承载性能,提出了一种可同时施加弯曲和剪切载荷并任意调节弯剪比的试验装置。通过设计3种不同弯剪耦合条件进行试验载荷的加载,使用应变片监测大尺寸碳纤维C型梁结构在屈曲以及后屈曲阶段应变分布状况。通过有限元模型对基于不同损伤准则的后屈曲行为进行预测。研究结果表明:大尺寸碳纤维C型梁在抗弯和抗弯剪耦合的载荷条件下,都具有优良的后屈曲承载能力;在2种弯剪耦合条件下,试验件分别在3.28倍和2.3倍设计载荷时发生梁腹板失稳现象,试验件进入后屈曲状态,继续进行弯剪耦合载荷的加载,达到4.6倍设计载荷后,样品出现局部损伤;采用Hashin和LaRC05准则对试验件损伤情况进行预测,破坏损伤形式分别为沿45°方向开始向外扩展和上部翼缘扭曲破坏。

316L不锈钢应变率硬化效应有限元模拟

基于316L不锈钢室温不同应变率下拉伸实验结果,分析了材料的应变率硬化效应,采用Abaqus软件选用Johnson-Cook(J-C)模型对材料的应变率硬化效应进行模拟。实验结果表明,应变率从0.001 s^(-1)增大到1 s^(-1),屈服强度增大了61 MPa,抗拉强度增加了35 MPa,分别产生302、293、269、276 MPa的应变硬化,应变硬化随应变率增加呈衰减趋势。在应变ε<0.1时,加工硬化率随应变率的增加而减小,当ε>0.1时,不同应变率下的加工硬化率曲线趋于吻合。基于不同应变率下的应力应变曲线确定参数,采用J-C模型对材料的应变率硬化效应进行模拟,得到的屈服应力与实验最大误差仅为7 MPa,整个模拟过程平均误差最大为4.2%。

C-TIRADS、弹性应变率及其联合诊断与BRAFV600E基因检测对甲状腺结节诊断价值的比较

探讨中国甲状腺影像报告和数据系统(C-TIRADS)、弹性应变率(SR)及其联合诊断与BRAFV600E基因检测对甲状腺结节良恶性的诊断价值。回顾性分析137例甲状腺结节患者的二维超声及弹性图像特征,记录SR比值,运用C-TIRADS分类进行恶性危险分层。以病理为金标准,评价上述方法诊断效能。C-TIRADS联合SR诊断效能较C-TIRADS、SR独立诊断方法升高,差异有统计学意义(P<0.05),但与BRAFV600E基因检测比较差异无统计学意义。

陶瓷基复合材料拉伸力学性能试验方法研究

本文以2D SiC/SiC、2.5D C/SiC与SiC/SiC拉伸试样为研究对象,通过试验方法对比了数字图像相关(DIC)、引伸计、应变片三种应变测量方式的测量结果,得出更准确可靠的应变测量方法;通过对比单调拉伸与循环加-卸载两种载荷形式下的试验结果,结合声发射信号,分析了不同载荷形式对测试结果的影响;针对PIP制备工艺,研究了同一构型对C/SiC与SiC/SiC两种材料的适用性。

18CrNiMo7-6合金钢J-C损伤模型失效参数研究

针对高速冲击、机械成型加工等数值模拟中广泛应用的Johnson-Cook(J-C)损伤模型失效参数求取问题,对18CrNiMo7-6合金钢材料开展了3个系列的力学实验。通过缺口试样准静态拉伸实验和有限元模拟,确定了既考虑空间分布效应,又考虑应变累积效应的应力三轴度的计算方法。结果表明:失效应变随应力三轴度的增大而减小;通过10^(-3)、10、10^(3)s^(-1)应变率下的拉伸实验与霍普金森拉杆(SHTB)冲击实验,发现随着应变率的增大,材料屈服强度有所增加,表明了材料有明显的应变率强化效应,并且失效应变随着应变率的增大而增大;在25、200、300、400℃的拉伸实验中发现随着温度的升高,材料屈服强度逐渐降低,但材料的抗拉强度在300℃时要高于200℃下的结果,并且随着温度的升高失效应变逐渐减小。根据上述实验结果拟合得到了J-C损伤模型失效参数,从拟合优度可以看出拟合所得参数的可靠性。最后通过Taylor冲击实验与有限元模拟进行验证,结果表明,当冲击速度为430 m/s时,实验与仿真得到的冲击试样均发生了破坏,并且有限元模拟得到的试样破坏形态与实验结果最大误差为6.3%,结果吻合良好,验证了所选用的J-C损伤模型的合理性以及实验所得参数的有效性。

2株高效脱氮菌的低温、低碳氮比驯化及应用

以强化土壤渗滤系统对北方农村生活污水脱氮效果为目标,从高效运行的土壤渗滤系统中层土壤中筛选出两株高效脱氮菌株Acidovorax(PM3)和Lysinibacillus fusiformis(PM7),通过逐步降低进水及C/N比和环境温度的方式驯化脱氮菌,并将驯化后菌株投加到土壤渗滤系统中.结果表明,PM3和PM7经过驯化后,对低温、低C/N比污水NH3-N的处理效率由初期的不足5%提高到了30%以上.将驯化后的菌株、未驯化的原代菌株分别投加到土壤渗滤系统中进行生物强化,投加驯化后菌株的系统对NH3-N及TN的处理率分别为57.36%及51.48%,比未投细菌的系统分别提高13.81%和19.50%,同时也比投加原代菌株的系统分别提高5.16%和8.12%.使用低温、低C/N驯化的菌株可有效生物强化土壤渗滤系统的脱氮性能,为其在北方寒冷地区对农村生活污水的处理提供解决途径.

猪瘟兔化弱毒疫苗——半个世纪的回顾

猪瘟是一种严重危害养猪业的毁灭性传染病。20世纪50年代中国首创了举世闻名的猪瘟兔化弱毒疫苗(即C株),随后创制了不同的疫苗制造工艺,如细胞培养苗、乳兔组织苗和牛体反应组织苗等。C株是一株非常安全的弱毒疫苗,对各种年龄和品种的猪都没有副作用,并且有良好的免疫效力,它能同时诱导体液免疫和细胞免疫应答,对不同基因型的猪瘟病毒株均能提供有效的免疫保护。免疫母猪通过母乳可对仔猪提供被动免疫保护,但过高水平的母源抗体会影响仔猪对C株疫苗的主动免疫应答。目前已经完成了包括C株及其亲本株在内的几十株猪瘟病毒的全基因组序列测定和注释,建立了猪瘟病毒的反向遗传操作系统,初步解析了猪瘟病毒主要基因的结构与功能,并构建了不同的反向遗传操作标记疫苗,赋予了C株疫苗新的生命和内涵。C株疫苗可以用于猪瘟的控制和根除,借助于C株疫苗密集接种和综合控制措施,有关国家有效地控制了猪瘟,甚至消灭了猪瘟。尽管如此,要在全球范围内根除猪瘟,今后依然有漫长的路要走,这可能有赖于对C株进行进一步改造和利用。

中国猪瘟兔化弱毒株(C-株)兔脾组织毒主要保护性抗原E2(gp55)基因序列分析

利用反转录 (RT)及套式PCR(N PCR)方法扩增了中国猪瘟兔化弱毒株 (C 株 )兔脾组织毒主要保护性抗原E2 (gp55)基因 ,成功地将其克隆并测定了核苷酸序列 ,与国内外已发表的猪瘟病毒 (HCV)E2基因序列比较的结果是 :C 株兔脾毒与C 株细胞 (SK6)毒、C 株疫苗 (犊牛睾丸细胞 ,HCLV C)毒、HCV SM株 (石门 )毒、Brescia株 (荷兰 )毒、Alfort株 (德国 )毒的E2核苷酸序列同源性分别为 98 87%、98 34 %、94 58%、91 0 0 %、80 78% ;氨基酸同源性分别为 98 95%、97 37%、94 2 2 %、91 60 %、89 2 3%。对C 株兔脾毒与C 株细胞毒、经典强毒及国内流行野毒E2上的A、B、C三个中和性抗原区的氨基酸组成进行了比较 ,其结果为 :C 株兔脾毒与C 株细胞毒的差异很小甚至没有差异 ,而与流行野毒及经典强毒在B、C区有较大的差异。我国经典强毒石门毒与国内80年代和 90年代流行毒之间有明显的差异 ,表明我国猪瘟流行毒株发生了变化。

中国猪瘟C-株(脾淋毒)全长cDNA的分子克隆

应用RT PCR、NestedPCR和Half nestedPCR技术从实验感染兔脾组织的总RNA中得到了覆盖猪瘟病毒(CSFV)C 株全基因组的7个cDNA重叠片段,分别克隆于pMD18 T或pGEM TEasy载体后进行测序。运用T A克隆和多片段一步连接法,将cDNA重叠片段F1、F2、F3、F4与F5、F6、F7分别克隆到pGEM 5Zf(+)载体后,得到两个半长cDNA亚克隆重组质粒pGEM 5Zf(+)/F1 4和pGEM 5Zf(+)/F5 7,再将两个半长cDNA重叠片段连接并克隆到pGEM 5Zf(+)载体,构建出了CSFVC 株全长cDNA重组质粒pGEM 5Zf(+)/F1 7。全长cDNA的成功构建为进一步研究CSFV分子生物学提供了良好的工具。

猪瘟病毒野毒株和兔化弱毒疫苗株复合实时荧光定量RT-PCR鉴别方法的建立

根据GenBank中的猪瘟病毒强毒和弱毒株基因组序列设计了1对针对猪瘟病毒的通用引物和2条分别针对猪瘟病毒强毒和猪瘟兔化弱毒疫苗株的特异性TaqMan水解探针，建立了一种能区分猪瘟病毒强毒和兔化弱毒疫苗株的复合实时荧光定量RT—PCR检测方法。结果显示，该方法能将我国大陆流行的不同基因亚群的猪瘟病毒强毒株与猪瘟兔化弱毒疫苗株完全区分开来，而不与其他猪源病毒发生非特异反应，分别可检测到初始模板中41．8和81．5个拷贝的病毒RNA，与已建立的复合RT-套式PCR的敏感性相近，两种方法对152份样品检测的符合率达96．9％～100％。通过对8份猪瘟兔化细胞疫苗效价的检测，证实本方法与兔体反应热测定法有一定的相关性，可用于猪瘟病毒强毒株和兔化弱毒疫苗的定量和鉴别检测。

异源猪瘟病毒C株E2基因保护性抗原编码区的序列分析与比较

应用ＲＴ－ＰＣＲ扩增了我国南京、成都、吉林３个兽医生物制品厂提供的猪瘟病毒兔化弱毒株（Ｃ株）的Ｅ２基因保护性抗原编码区，然后将其克隆到ｐＧＥＭ－Ｔ载体中，用Ｓａｎｇｅｒ′ｓ双脱氧法对重组质粒中的插入片段进行了序列分析。将测得的这３个厂生产的Ｃ株的核苷酸序列及其推导的氨基酸序列与作者实验室测得的国内石门株和国外测得的Ｃ株相同区域进行同源性比较，发现不同来源的Ｃ株及石门株之间存在不同程度的差异，核苷酸同源性为９３．６％～９９．６％，氨基酸同源性为９０．６％～９８．９％。

猪瘟病毒野毒株与疫苗株双重SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法的建立

为建立猪瘟病毒(CSFV)兔化弱毒疫苗(C株)与野毒株的快速鉴别检测方法,本研究根据GenBank登录的CSFV C株与野毒株的E2基因序列差异,设计2对特异性引物,建立了同时检测C株与野毒株的双重SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法。应用该方法对CSFV野毒和疫苗株的最低检出量为10拷贝;检测牛病毒性腹泻病毒Ⅰ型、猪繁殖与呼吸综合征病毒、伪狂犬病病毒和猪圆环病毒2型4种病毒均呈阴性;批内、批间重复试验的变异系数均低于3%。应用该方法检测从黑龙江省各地区猪场采集的600份样品,结果表明野毒株的阳性率为30.5%。该方法可应用于CSFV野毒株和C株的鉴别检测。

免疫外科法分离克隆BALB/c小鼠胚胎干细胞

目的 使用免疫外科法分离克隆BALB c小鼠胚胎干细胞 (embryonicstemcells,ES细胞 ) ,为进一步建立BALB c小鼠ES细胞系打下基础。方法 用免疫外科法从 4 5枚BALB c小鼠囊胚中分离得到 2 0枚去除滋养层细胞的ICM ,接种在MEF饲养层上 ,使用DMEM(高糖 ) +15 %FBS +0 1mmol Lβ 巯基乙醇 +0 0 1mmol L非必需氨基酸 +10 0 0IU mlLIF +10 0IU mL青霉素 +10 0IU ml链霉素培养液 ,17枚形成典型的ICM集落 (85 0 % ) ,有一枚胚胎传至第 10代。用于全胚培养的BALB c小鼠胚胎共 10 2枚 ,使用与免疫外科相同的培养方法 ,6 6枚形成典型的ICM集落 (6 4 7% ) ,其中一枚胚胎传至第 8代。结果 免疫外科法较全胚培养法有利于小鼠ES细胞的分离与克隆 ;添加LIF(10 0 0IU ml)有利于小鼠ES细胞的分离与传代 (P <0 0 5 ) ;0 0 5 %胰酶 +0 0 0 8%EDTA是较好的ES细胞消化液 ,对细胞综合损伤力小 ,且传代后ES细胞集落形成能力也较高 (P <0 0 5 )。结论 分离得到的ES细胞经形态学观察 ,AKP染色 ,体外分化实验 ,核型分析等证明其具有胚胎干细胞的诸多特性。

猪瘟病毒兔化弱毒株全长cDNA克隆的感染性鉴定

用SrfⅠ限制性内切酶将构建的猪瘟病毒兔化弱毒株(C 株)全长cDNA线性化,体外转录获得其基因组RNA,利用脂质体将基因组RNA转染至SK 6细胞系,连续传代,收集5代以后培养细胞,采用RT PCR、荧光抗体直接法、夹心ELISA进行鉴定。结果表明,所构建的全长cDNA具有感染性。猪瘟病毒C 株全长感染性cDNA的成功构建,为在分子水平上进一步研究中国猪瘟病毒兔化弱毒株提供了极有价值的研究工具。

猪瘟病毒及其全长cDNA在猪肾细胞中增殖表达特性的比较研究

以猪瘟C-株弱毒疫苗株、经典强毒石门株和C-株全长cDNA为试验材料,以免疫荧光技术为主;结合ELISA和RT-PCR检测技术,对其在培养细胞中的增殖特性和表达规律进行了比较研究。同时筛选猪瘟病毒及其全长cDNA的敏感细胞,探索其增殖表达规律,以便为猪瘟病毒反向遗传操作提供技术方法和可操作的条件。

猪瘟病毒强毒株和兔化弱毒疫苗株RT-PCR快速鉴别检测方法的建立

【目的】建立猪瘟病毒强毒株和兔化弱毒疫苗株的RT-PCR快速鉴别检测方法。【方法】根据Gen-Bank中36株猪瘟病毒(CSFV)强毒株和兔化弱毒疫苗株的基因序列,分别设计了针对CSFV强毒和兔化弱毒疫苗株的特异性引物,建立了一种能区分CSFV强毒和兔化弱毒疫苗株的RT-PCR检测方法。【结果】建立的RT-PCR检测方法可以从CSFV强毒株和兔化弱毒疫苗株中分别扩增出大小为187和492 bp的特异性片段,对猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪圆环病毒2型(PCV2)和猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)等猪源性病毒的检测结果均为阴性,说明该方法具有较好的特异性。对10份疑似猪瘟临床样品进行检测后发现,利用该方法可以从中分别检测出CSFV强毒和疫苗毒。【结论】建立了可鉴别检测CSFV强毒株和弱毒疫苗株的RT-PCR方法,为猪瘟的早期诊断及疫苗免疫猪和野毒感染猪的鉴别提供了技术参考。

猪乳中抗猪瘟IgA、IgG、IgM抗体动态变化规律研究

以猪瘟弱毒疫苗免疫空怀母猪,待母猪分娩后,分别收集10 d内的乳汁,以建立的间接ELISA方法检测猪瘟IgA、IgG、IgM水平,并观察各种抗体动态变化规律。试验结果表明,猪初乳中的IgA、IgG、IgM抗体效价均在分娩当天达到最高值,随后迅速下降,7 d后抗体水平与常乳基本一致。对照组母猪仅在分娩当天检测到较低的抗体水平。

吸水链霉菌NND-52-C基因工程宿主载体系统的构建

吸水链霉菌NND 5 2 C菌株是大环内酯类抗生素 阿扎霉素B的高产菌株。采用原生质体转化技术 ,将来自变铅青链霉菌TK2 4菌株的pIJ70 2质粒转化吸水链霉菌NND 5 2 C菌株的原生质体 ,建立了吸水链霉菌NND 5 2 C菌株的基因工程宿主载体系统。确定了NND 5 2 C菌株原生质体制备和再生的条件 ,其原生质体形成率达到 1 0 8个 mL ,再生率约为 0 2 % ,转化率为 1 0 2 ～ 1 0 3个转化子 μg质粒DNA。