基于锁式探针的番茄溃疡病菌实时荧光PCR快速检测

【目的】从口岸进境番茄种子中检测番茄溃疡病菌(Clavibacter michiganensis subsp.michiganensis,CMM),一直以来都受检测周期的限制,快速、特异地从种子中检测该病原细菌需要新的方法。研究在锁式探针扩增方式上,选择连接酶依赖的PCR扩增方式,并结合实时荧光PCR技术,旨在建立番茄溃疡病菌基于锁式探针技术的实时荧光PCR快速检测方法,为口岸番茄种子快速检疫提供技术支持。【方法】根据番茄溃疡病菌的一段特异基因Pat-1序列,设计锁式探针的T1和T2臂,使之与CMM的特异性片段碱基序列互补,再按照锁式探针的设计原则设计锁式探针和扩增引物以及荧光探针。试验时,先将锁式探针与CMM以及参照菌株的DNA模板在DNA连接酶作用下分别进行环化连接,再用核酸外切酶Ⅰ和核酸外切酶Ⅲ消化未环化的线性锁式探针,最后以环化的锁式探针为模板,在扩增引物的作用下进行实时荧光PCR试验。建立CMM基于锁式探针技术的实时荧光PCR检测方法,分别比较该方法的特异性和灵敏度与常规PCR方法的差异,并用该方法对收集的来自日本、韩国和中国台湾的番茄种子以及国内采集的共45份样品进行检测。【结果】基于锁式探针技术的实时荧光PCR检测方法能够从供试的菌株中特异性地检出CMM,在供试的10种菌株中,只有靶标细菌能被特异性地检测到阳性,空白对照和其他参试菌株均没有荧光信号的增加,检测为阴性。比较该检测方法与常规PCR方法,其特异性和常规PCR方法一致。该检测方法检测灵敏度高,DNA最低浓度检测为50 fg·μL-1,而常规PCR方法检测DNA最低浓度为5 pg·μL-1,灵敏度高于常规PCR两个数量级。对收集的样品进行检测,结果显示,45份样品中共有5份样品CMM检测结果为阳性,分别是日本的番茄种子样品2份(编号Jap1214、Jap1102),永泰采集的样品2份(编号为Yongt1001、Yongt1002)和闽清采集的样品1份(编号为Minq1001)。【结论】建立的基于锁式探针技术的荧光PCR方法具有高度的特异性和灵敏度,应用该检测方法对收集的进境番茄种子进行检测,可以直接从番茄种子中检测到CMM,该方法适合口岸番茄种子CMM的快速检测,有较好的口岸检疫实际应用价值。

苜蓿萎蔫病菌Taq Man探针实时荧光PCR检测方法的建立

苜蓿萎蔫病菌是我国对外检疫性二类有害生物 ,目前国内尚无发生。在出入境检验检疫中主要是采用生物学和血清学方法进行检测 ,劳动强度大 ,耗费时间长。根据苜蓿萎蔫病菌与其它细菌菌株 1 6SrDNA序列差异 ,设计出对苜蓿萎蔫病菌具有稳定点突变特异性探针 ,利用该探针对棒形杆菌属 4个种及其它属细菌进行了实时荧光PCR检测实验。结果表明 ,只有苜蓿萎蔫病菌能检测到荧光信号 ,其它细菌没有荧光产生。该方法特异性强 ,灵敏度高 ,能检测到 2 1 4fg质粒DNA ,比常规PCR灵敏 1 0 0倍 ,而且整个过程只需要 2～ 3h。该方法可有效地应用于进出境病原菌检测之中。

番茄溃疡病菌实时荧光PCR快速检测方法研究

根据番茄溃疡病菌ITS(16S^23SrDNA间隔区)基因序列,设计并合成了荧光PCR检测引物(Fan1和Fan2)及特异性检测探针(Fanprobe),对番茄溃疡病菌和非番茄溃疡病菌的标准菌株实时荧光PCR反应。结果表明,番茄溃疡病菌PCR产物出现强烈的特异杂交信号,而非番茄溃疡病菌均未出现特异荧光信号,证明这对引物及探针具有番茄溃疡病菌鉴定特异性。将番茄溃疡病菌DNA做梯度稀释,测定该检测体系的敏感度,结果表明,此体系可检出52.3 fg/μL的模板。

PCR技术快速检测玉米内州萎蔫病菌研究

玉米内州萎蔫病是北美玉米生产中的严重病害,为防止其传入我国,本研究采用Clavibacter michiganensis不同亚种的转录间隔区序列,设计了特异性的PCR引物,对C.michiganensis种下不同亚种的DNA进行了PCR扩增反应,结果表明,只有玉米内州萎蔫病菌的特异性扩增得到大小为170bp的目标片段,且仅有此一条明显的PCR扩增产物,C.michganensis种下其他亚种无扩增产物。PCR反应的灵敏度为4.36×105cfu/mL和1.56×102pg,可以满足检疫的要求。

EMA-qPCR方法快速检测番茄溃疡病菌活菌研究

将叠氮溴乙锭(EMA)与实时荧光定量PCR技术相结合(EMA-q PCR),建立一种有效快速检测番茄溃疡病活菌的方法。以番茄溃疡病菌Pat-1基因为检测靶标,菌体经EMA渗透处理,再进行q PCR特异性扩增。结果显示,q PCR检测灵敏度为1.0×101CFU/m L;当EMA的浓度为2.0μg/m L时,能有效抑制1.0×107CFU/m L灭活死菌的扩增,对活菌的扩增没有影响。当活菌数在1.0×101~1.0×105CFU内,每个q PCR反应体系中活菌CFU数与Ct值呈线性相关(R2=0.987)。不同温度处理后EMA-q PCR检测番茄溃疡病菌的存活情况并与平板计数法进行比较,表明待检样品可在4和20℃短期保存。对疑似带病番茄种子样品进行EMA-q PCR检测,发现EMA-q PCR方法能减少番茄溃疡病菌PCR检测的假阳性结果。本研究建立的EMA-q PCR方法是一种能有效检测番茄溃疡病活菌的方法,并能有效避免PCR检测实际样品可能造成的假阳性结果。

ELISA及实时荧光PCR检测番茄细菌性溃疡病菌的方法比较

本文以番茄细菌性溃疡病菌（Clavibacter michiganensis subsp．michiganensis）菌悬液和田间采集的病组织为材料，比较ELISA试剂盒、常规PCR方法和实时荧光PCR方法检测番茄细菌性溃疡病菌灵敏度和适用性。结果表明，ELISA试剂盒检测灵敏度为10^5 cfu／mL，具有简便、快速、易操作特点，适用于田间病害诊断；常规PCR检测灵敏度为10^5cfu／mL；TaqMan探针实时荧光PCR检测灵敏度为10^3-4cfu／mL，比常规PCR和ELISA检测灵敏度提高10—100倍，且不需要琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色和Southern杂交，但需要昂贵的仪器和试剂，适用于室内检测及相关研究。

进境玉米种子携带内州萎蔫病菌的巢式PCR检测

依据GenBank中玉米内州萎蔫病菌[Clavibacter michiganensis subsp.nebraskensis(Cmn)]与常见近缘属种、亚种的16S-23S转录间隔区序列差异,设计巢式PCR检测引物(外围引物:CM-FO/CM-RO,内嵌引物:CM-FI/CM-RI),能分别从供试的玉米内州萎蔫病菌基因组DNA中特异性扩增出324bp和163bp的特异性条带。外围引物对Cmn基因组DNA的检测下限为0.1ng,内嵌引物的检测下限为0.1pg;外围引物对Cmn菌悬液的检测下限为7.21CFU,内嵌引物的检测下限为7.21×10-1 CFU。玉米种子接种Cmn模拟试验证明,外围引物检测下限是5 000个细胞,内嵌引物的检测下限可达到500个Cmn细胞。可见,建立的Cmn巢式PCR快速检测试验技术体系,适合于进境玉米种子携带内州萎蔫病菌的快速检测。

番茄细菌性溃疡病研究进展

根据国内外近年来番茄溃疡病的研究概况,对番茄溃疡病的历史、主要症状、病原菌的分类地位及生物学特性、病原菌的分离、检测和鉴定技术、病害的田间发生、流行条件及防治方法进行了综述,分析了我国加入世界贸易组织后实施《卫生与植物卫生措施协定》以及农产品安全条例等,认为做好番茄溃疡病风险性分析、监测国际种子贸易传入该病害的可能性非常重要,同时提出了今后加强番茄溃疡病研究的主要方向。

番茄溃疡病菌分子检测技术

对中国三类检疫性有害生物番茄溃疡病菌(Clavibactermichiganensissubsp.michiganensis)进行PCR检测方法的研究。利用1对特异性引物ClaF1ClaR2,对5个番茄溃疡病菌进行特异性扩增,得到了一段长250bp的PCR产物,参试的其他棒形细菌以及其他属的植物病原细菌均无扩增产物。该检测方法特异性强、灵敏度高,在50pg的模板DNA浓度下还能检测到很强的条带。利用此引物可以检测到1×105个菌体。

新疆加工番茄溃疡病的发生及其病原菌研究

【目的】番茄溃疡病是番茄上最严重、最具毁灭性的病害之一，2010年6～8月在新疆石河子、奎屯等地的加工番茄田间相继发现典型症状的病株和病果。旨在明确引起该病害的主要病原菌种类，为进一步的防治研究打好基础。【方法】对采集的病株、病果进行病原菌的分离纯化，应用注射法、剪叶法及喷雾接种测定菌株的致病性；通过供试菌株的形态学特征、培养特性、生理生化反应的测定、16SrDNA序列分析及番茄溃疡病菌特异性引物的PCR检测确定病原的归属。【结果】所有供试菌株对供试番茄都具有致病性，表现为茎秆爆裂，植株萎蔫死亡。菌株形态特征、培养特性及生理生化反应都与密执安棒形杆菌密执安亚种（Clavibacter michiganense subsp．michiganense）的特征相一致；供试菌株16SrDNA核苷酸序列与德国已报道的密执安棒形杆菌密执安亚种菌株的核苷酸序列同源性为99．86％；特异性引物检测也得到预期目标片段。【结论】因此，将此病害确定为番茄溃疡病，其病原为密执安棒形杆菌密执安亚种（ C. michiganensis subsp. Michiganensis ）。

番茄溃疡病菌LAMP快速检测方法的建立

以SYBR Green I为指示剂,建立了番茄溃疡病菌的环介导等温扩增可视化快速检测方法。根据番茄溃疡病菌特异的核糖体转录间隔区序列设计了4条引物进行LAMP扩增,通过对体系中各成分进行优化,最终确定25μL反应体系中模板200ng,MgSO4的适宜浓度为3.0mmol/L,Bst DNA聚合酶2U,dNTPs的适宜浓度为0.3mmol/L,外引物与内引物之比为1∶3时扩增效果较好,在65℃最佳反应时间为40min。在优化的体系条件下,获得的反应产物经SYBR Green I染色后,肉眼观察检测灵敏度可达到50CFU/mL,且对番茄溃疡病菌的检测具有高度的特异性。结果表明,该方法快速、准确、灵敏、特异,具有良好的实用性。

苜蓿细菌性萎蔫病菌16S rDNA片段的克隆及序列分析(简报)

利用细菌16S rDNA保守序列通用引物对16sF/16sR对苜蓿细菌性萎蔫病菌的标准菌株(IPQ0019)总DNA进行扩增,得到了大约1.5 kb的片段。将此片段插入到pGEM-T载体并转化进大肠杆菌DH5α菌株中,经PCR鉴定、限制性内切酶分析及核苷酸序列同源性分析均表明克隆成功。该研究为制备苜蓿细菌性萎蔫病菌的DNA分子探针奠定了基础。

番茄溃疡病生防菌YH23的发酵条件优化及菌种鉴定

海洋是当前放线菌资源的重要来源,由于其独特的生态环境造就了代谢系统多样的放线菌,随着研究的深入,有望获得具有不同抑菌活性的有益菌株。从大连黄海海域海底沉积物样品中分离得到1株放线菌YH23,为进一步开发其在生物防治中的应用潜力,采用牛津杯法检测其发酵液对番茄溃疡病菌(Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis, Cmm)的抑菌活性,并采用单因素试验与正交设计方法筛选出该菌株的最优发酵配方和发酵条件,同时通过形态观察、生理生化反应及16S rDNA序列分析初步确定了该菌株的分类地位。结果表明:YH23发酵液对番茄溃疡病菌(Cmm)具有抑制活性;其优化后的发酵培养基组分为黄豆粉10g,地瓜粉10g,氯化钠2g,碳酸钙1g,去离子水1L;优化后的发酵条件为初始pH值6.0,发酵温度25℃,发酵时间5d,接种量8%,装液量75mL/250mL,转速为150r·min^-1,优化后发酵液的最佳抑菌圈直径较初始发酵液增大47.2%;该菌株16S rDNA序列与密旋链霉菌(Streptomyces pactum NBRC 13433T)相似度为99.58%,聚类分析显示二者亲缘关系最近,结合形态特征及生理生化特性最终确定该菌株YH23为密旋链霉菌(Streptomyces pactum)。

番茄溃疡病菌检测技术研究进展

概述了几种常见的番茄溃疡病菌检测技术,包括血清学检测技术、PCR技术、实时荧光PCR技术、Rep-PCR技术、核酸分子杂交检测技术,并对番茄溃疡病检测技术进行了展望。

基于锁式探针技术快速检测玉米细菌性枯萎病菌和玉米内州萎蔫病菌

目的:建立一种检测玉米细菌性枯萎病菌和玉米内州萎蔫病菌的方法,为同时检测这2种检疫性细菌提供技术手段。方法:基于靶标序列设计2种检疫性细菌的锁式探针,与靶标菌进行连接消化反应,然后采用通用引物进行滚环扩增,其产物与偶联上对应捕获探针的微球进行杂交,最后通过液相悬浮芯片二重检测。结果:该检测方法能够有效地检测2种检疫性细菌,其检测阈值为103CFU/m L,具有良好的可重复性。结论:建立了一种快速、灵敏的玉米细菌性枯萎病菌和玉米内州萎蔫病菌的二重检测方法。

番茄溃疡病一步法快速超灵敏检测技术研究

对种子携带的番茄细菌性溃疡病菌（Clavibactermichiganensissubsp，michiganensis）进行简单抽提和纯化，不经过DNA提取而以病原菌为模板直接进行一步法PCR检测，对纯菌液Direct—PCR最低检出限为2600个细菌／mL，而Nested-PCR最低检出限可达到13个细菌／mL；对种子提取液，Direct-PCR不能检出，而Nested—PCR最低检出限可达到3×10^5个细菌／mL,一步法Nested-PCR可在12h内对番茄种子携带的番茄溃疡病菌进行准确的定性鉴定。并且方法方便快速，成本低，灵敏度高，适用于种子携带番茄溃疡病菌的快速鉴定。

番茄溃疡病一步法快速检测技术研究

对番茄细菌性溃疡病菌进行种子带菌的模拟检测试验。对用菌液处理过的种子进行简单抽提和纯化,不经过DNA提取而以抽提和纯化的病原菌为模板直接进行一步法PCR检测,对纯菌液D irect-PCR最低检出限为2 600个细菌/m l,而N ested-PCR最低检出限可达到13个细菌/m l;对种子提取液,D irect-PCR不能检出,而N ested-PCR最低检出限可达到3×105个细菌/m l。一步法N ested-PCR可在12 h内对番茄种子携带的番茄溃疡病菌进行准确的定性鉴定。并且方法方便快速,成本低,灵敏度高,适用于种子携带番茄溃疡病菌的快速鉴定。

番茄内生细菌对番茄溃疡病菌拮抗作用的研究

为了筛选出对番茄溃疡病菌有拮抗作用的内生细菌,从健康番茄茎样本中分离得到186株内生细菌。用抑菌圈法测定,其中9株内生细菌对番茄溃疡病菌有拮抗作用。通过形态特征观察、生理生化特性测定和16 S rDNA序列分析,对拮抗作用较强的7个菌株进行了鉴定。结果表明,BM-31、BT-10、BT-9、BT-7、BT-3为微杆菌(Microbacteriumspp.),QB-22和QB-8为假单胞菌(Pseudomonasspp.)。

加工番茄溃疡病药剂防治的室内毒力测定及田间药效研究

【目的】筛选出防治加工番茄溃疡病高效、低毒的药剂,为防治加工番茄细菌性溃疡病提供科学依据。【方法】通过室内毒力测定和田间药效测定方法,测定9种杀菌剂防治加工番茄细菌性溃疡病的效果。【结果】供试9种杀菌剂中,46%氢氧化铜的抑菌效果最好,EC50最小,为15.1μg/mL。氯溴异氰尿酸的抑菌效果最差,EC50最大,为682.3μg/mL。田间试验结果表明,2500μg/mL46%的氢氧化铜（可杀得三千）,氢氧化铜（53.8%）对番茄溃疡病防治效果较好,达到50%~80%;400μg/mL氯碘霉素,200μg/mLN-N-二辛基二乙烯三肟,300μg/mL农用硫链霉素,效果次之,防效为50%左右,春雷霉素易对番茄产生药害。【结论】施用46%的氢氧化铜（可杀得三千）、53.8%氢氧化铜,对番茄溃疡病防治效果好,且对番茄安全,禁止施用春雷霉素。

不同来源番茄溃疡病菌致病力差异研究

采用打顶法接种、半选择性培养基再分离发病植株中的病原菌，以及特异性PCR验证方法，对来自3个国家9个不同地区的46株番茄溃疡病菌进行了致病性测定，以病情指数评价不同菌株的致病力。结果显示，分离自我国河北滦平县、内蒙古包头市等地的24株菌株的病情指数达到75以上，属于强致病力水平；11株菌株的病情指数为50-75，属于中等致病力；而9株菌株的病情指数为50以下，属于弱致病力；检测同时证实，有2株属于无致病力菌株。强致病力、中等致病力、弱致病力和无致病力菌株占供试菌株总数的比例分别为52．2％、23．9％、19．6％和4．3％，表明供试的46株番茄溃疡病菌存在不同程度的致病力差异。