过敏毒素受体(C3aR)在db/db糖尿病肾病小鼠肾脏中的表达及病理意义分析

利用半定量RT-PCR、免疫组化和Western blotting的方法,同时从mRNA水平和蛋白质水平对过敏毒素受体(C3aR)在不同病理阶段的2型糖尿病肾病模型小鼠——db/db小鼠肾脏中的表达情况进行了较为系统的分析.结果发现:a.在糖尿病前的db/db小鼠(4周龄的db/db小鼠),C3aR与作为正常对照的db/m小鼠相比没有明显差异.随着肥胖的加剧,高血糖、蛋白尿的发生和发展,C3aR在db/db小鼠肾脏中的表达显著升高.b.免疫组化分析显示,C3aR广泛地表达于db/m和db/db小鼠肾脏的皮质和髓质,分布于肾脏的上皮细胞中(包括肾小管上皮细胞、肾小球中的脏层上皮细胞(足细胞)和壁层上皮细胞).从部位来看,皮髓交界处的肾小管中C3aR表达量明显要比其他部位的多.在肾小球,C3aR特异地存在于足细胞部位.在db/m小鼠,不同周龄小鼠肾脏中C3aR的表达量并没有明显变化,但在db/db小鼠,从8周龄开始,分布在db/db小鼠肾小管上皮细胞和小球足细胞中的C3aR均随小鼠周龄的增加而增加,至少在时间上,与小鼠糖尿病肾病的发生发展相关,其中尤以足细胞中和皮髓交界处肾小管上皮细胞中的变化最为明显.c.在糖尿病肾病小鼠中高表达C3aR的肾小管上皮细胞常有空泡变性的情况.上述工作印证了先前对2型糖尿病肾病患者肾小球基因表达谱的分析结果,更加明确了C3aR与糖尿病肾病的相关性,同时揭示了C3aR在正常小鼠和糖尿病肾病小鼠肾脏中的表达、分布和变化规律,有利于进一步揭示C3aR的功能及其在糖尿病肾病发生、发展过程中的可能作用,探讨糖尿病肾病的分子机制。

高表达C3aR的肥大细胞在糖尿病肾病患者肾组织中的分布及病理意义分析

选取糖尿病肾病(diabetic nephropathy,DN)早期、中期、晚期以及正常移植供肾各15例,分别作为DN早期组、中期组、晚期组和正常对照组,利用各个病例的肾穿刺组织标本进行C3aR免疫组化染色,分析各组中高表达C3aR浸润细胞的数量和分布特点,及其与DN发生、发展的关系,利用连续切片、免疫荧光双套色染色、免疫电镜、及甲苯胺蓝染色等方法对DN患者肾组织中高表达C3aR的浸润细胞进行细胞类型鉴定.结果表明:a.光镜和免疫电镜的形态学分析显示DN患者肾组织中高表达C3aR的浸润细胞在形态上具有肥大细胞的特点,免疫荧光双套色染色的分析显示,C3aR浸润细胞CD45阴性、CD68和类胰蛋白酶阳性,与肥大细胞的情况一致,甲苯胺蓝特殊染色进一步证实这是一种肥大细胞.b.正常移植供肾组织中虽有肥大细胞分布,但数量很少;从DN早期组到DN中期组,再到DN晚期组,肾组织中肥大细胞的数量有一种不断增加的趋势;DN患者肾组织肥大细胞的数量与24 h尿蛋白和血肌酐水平均具有很好的线性相关性.上述工作不仅揭示了在DN发生发展过程中肥大细胞在DN患者肾组织中的数量及分布情况,提示肥大细胞很可能参与了DN的发生发展过程,同时,DN患者肾组织肥大细胞高表达过敏毒素C3a受体C3aR的发现,提示C3a/C3aR通路很可能在DN患者肥大细胞的招募和激活过程中有重要作用.

C3aR——检测肾组织肥大细胞的敏感标志

目的:探讨过敏毒素受体C3aR高表达细胞在正常个体和各种肾脏病患者肾组织中的分布情况,对其细胞类型进行鉴定,并对C3aR能否作为肥大细胞特异性标记分子进行评估。方法:利用免疫组化的方法分析C3aR高表达细胞在正常供肾组织和包括2型糖尿病肾病(T2DN)、IgA肾病、急性间质性肾炎、慢性间质性肾炎、ANCA相关性血管炎、微小病变性肾病、膜性肾病、局灶节段性肾小球硬化(FSGS)以及狼疮性肾炎在内的各种肾脏病患者肾组织中的分布情况;利用光镜、免疫电镜、免疫荧光双套色染色和甲苯胺蓝特殊染色等方法对肾组织中高表达C3aR的细胞类型进行鉴定;在此基础上,对C3aR作为肾组织肥大细胞特异性标记分子进行评估。结果:(1)C3aR高表达细胞在正常供肾组织和包括T2DN、IgA肾病、急性间质性肾炎、慢性间质性肾炎、ANCA相关性血管炎、微小病变性肾病、膜性肾病、FSGS以及狼疮性肾炎在内的各种肾脏病患者肾组织中均存在。(2)光镜和免疫电镜的形态学分析显示肾组织中高表达C3aR的浸润细胞在形态上具有肥大细胞的特点;免疫荧光双套色染色的分析显示,这种细胞CD45阴性、CD68和类胰蛋白阳性,与肥大细胞的情况一致;甲苯胺蓝特殊染色进一步证实其为肥大细胞。(3)虽然C3aR也同时表达于小管上皮细胞等其他细胞,但其在肥大细胞中的表达水平远远高于其他细胞,这种表达水平差异足以区分肥大细胞与其他细胞。(4)与目前最常用的肥大细胞标记分子——肥大细胞类胰蛋白酶相比,C3aR作为肥大细胞的标记分子具有相似的检测灵敏度和更好的特异度。结论:C3aR在肾组织肥大细胞特异性地高表达,是肾组织肥大细胞的一个敏感标记分子,完全可代替类胰蛋白酶,以免疫组化的方法检测肾组织中的肥大细胞。

过表达C3AR1基因促进HL-60细胞迁移和侵袭

目的:探讨C3AR1基因对人早幼粒细胞白血病细胞株(Human promyelocytic leukemia cells,HL-60)迁移及侵袭的作用和机制。方法:构建HL-60-C3AR1过度表达的细胞株并使其稳转表达。利用transwell小室进行迁移及侵袭实验,应用PCR array和流式细胞术探讨其可能的机制。结果:合适C3AR1的HL-60细胞在C3a和SDF-1的作用下,其细胞迁移及侵袭能力较转染空载体细胞明显增强。PCR array检测发现,包括CCL2在内的16个基因显著上调,而4个基因显著性下调,但与CXCR4基因的表达无关。结论:C3a和SDF-1促进过表达的C3AR1细胞迁移和侵袭,其机制与调控CCL2等相关基因有关。

C3aR慢病毒表达载体的构建及在肾小管上皮细胞中的转染实验

目的前期研究发现C3aR在糖尿病肾病肾小管上皮细胞中表达上调,但其在糖尿病肾病中的病理意义未知,且有关肾组织C3aR的确切生理和病理意义亦仍不清楚。文中通过构建C3aR慢病毒表达载体和过表达C3aR的肾小管上皮细胞株,为探讨C3aR在肾组织小管上皮细胞中的确切生理和病理意义提供细胞模型。方法根据人C3aR mRNA序列合成人C3aR基因,将其克隆到慢病毒表达载体p Lenti6.3-MCS-IRES2-EGFP的多克隆位点,构建成C3aR慢病毒表达载体p Lenti6.3-C3aR-IRES2-EGFP;经测序验证正确后,用构建的慢病毒表达载体p Lenti6.3-C3aR-IRES2-EGFP和包装质粒共转染293T细胞,包装成C3aR表达重组慢病毒;以C3aR表达重组慢病毒感染人肾小管上皮细胞系HK2,经药物筛选得到杀稻瘟菌素抗性细胞克隆;经荧光定量PCR分析和细胞免疫化学分析,鉴定出稳定过表达C3aR的人肾小管上皮细胞株。结果 1对构建成的C3aR慢病毒表达载体p Lenti6.3-C3aR-IRES2-EGFP进行全序列测序验证显示序列完全正确。2以构建的C3aR慢病毒表达载体和包装质粒(p LP1、p LP2和p LP/VSVG)共转染293T细胞,48 h后收集细胞培养上清,得到了滴度约为5×108个/m L的慢病毒液。3成功进行了C3aR重组慢病毒对HK2细胞的转染,得到了稳定转染了C3aR重组慢病毒的HK2细胞株HK2-C3aR;基于荧光定量PCR和细胞免疫化学染色的分析证实HK2-C3aR细胞株中C3aR表达水平较HK2非转染对照细胞高(2.33±0.45 vs 1.00±0.09,P<0.05)。结论成功构建了C3aR慢病毒表达载体和过表达C3aR的人肾小管上皮细胞株,为进一步研究C3aR过表达在人肾小管上皮细胞中的病理意义提供了很好的细胞模型,也为进一步开展C3aR在其他细胞中的生理、病理意义创造了条件。

C3aR过度活化与糖尿病肾病肾组织损伤的关系

C3aR是补体C3裂解产物C3a的受体.最近的一些研究提示C3aR通路可能参与了糖尿病肾病(DN)的病理过程,但有关C3aR通路在DN中的确切病理作用及有关机制远未清楚.需要特别指出的是,现有的有关C3aR参与DN肾组织损伤的证据主要来自一些动物模型的研究,临床上尚缺乏较为系统全面的对DN患者肾组织C3aR通路与肾组织损伤关系的观察分析.为此,本文首次以较大的样本量分析了不同病理时期DN患者肾组织C3aR和C3a的表达变化情况及其与DN患者肾组织损伤的相关性.在此基础上,进而利用体外细胞模型,对高糖环境下C3aR活化致肾小球足细胞损伤的作用及机制进行了探讨.结果显示:a.与正常对照组相比,DN患者肾组织C3a和C3aR的表达水平随DN的进展而升高,C3aR在DN患者肾组织中的表达上调主要见于肾小管上皮细胞和肾小球足细胞;b.DN患者肾组织C3aR和C3a水平与患者肾组织损伤程度,特别是小管和小管间质损伤程度、肾小球足细胞损伤程度具有显著相关性;c.外加C3a激活C3aR可使高糖环境中的足细胞的细胞骨架发生明显改变、足细胞标记分子表达下调、足细胞通透性增加.这些结果说明:a.DN患者肾组织中确实存在C3a/C3aR轴过度活化的现象;b.C3a/C3aR轴的过度活化很可能在DN患者肾组织损伤,特别是小管和小管间质损伤、肾小球足细胞损伤中具有重要作用;c.可能通过破坏成熟足细胞特有的细胞骨架,改变足细胞标记分子表达,增加足细胞的通透性,C3a/C3aR轴过度活化参与DN足细胞损伤过程.本文不仅为C3a/C3aR通路参与DN病理过程提供了新的必不可少的临床证据,也增加了对C3a/C3aR通路过度活化致DN患者肾组织损伤机制,特别是肾小球足细胞损伤机制的了解,这对于拓展对DN病理机制的认识,发展DN防治新思路,无疑都是有益的.

缺氧通过HIF-1α/NF-κB通路诱导肾小管上皮细胞C3aR表达（英文）

C3aR是补体C3a的受体.在肾脏,已发现C3aR表达于包括肾小管上皮细胞在内的多种细胞.在特定的病理情况下,C3aR表达上调并参与多种肾脏疾病的病理过程,但有关C3aR在肾脏细胞中的表达调控机制仍不清楚.小管间质缺氧是肾脏疾病中的一种常见现象,也是一种重要致病因素.为了探讨缺氧对C3aR的表达调控作用,本文利用体外缺氧模型,对模型条件下C3aR在肾小管上皮细胞中的表达变化情况进行了分析,同时检测了HIF-1α和NF-κB的表达变化及活化情况,以及HIF-1α和NF-κB抑制剂对C3aR的表达影响情况.结果发现缺氧可诱导C3aR mRNA及蛋白质水平的表达上调、HIF-1α和NF-κB的核转移.HIF-1α和NF-κB抑制剂可阻断缺氧对C3aR的诱导作用,且HIF-1α抑制剂可抑制NF-κB的核转移.这些结果说明缺氧可通过HIF-1α/NF-κB通路诱导肾小管上皮细胞C3aR的表达.考虑到C3aR活化可促进肾小管的损伤,我们推测C3aR通路可能参与了缺氧和NF-κB诱导的肾小管损伤过程,可能是防治缺氧和NF-κB诱导肾组织损伤的一个新靶标.

低表达C3aR人肾足细胞的构建及鉴定

目的前期的研究中发现过敏性毒素C3a受体(C3aR)在糖尿病肾病病中表达增加,但在糖尿病肾中的病理意义及其在肾组织足细胞中的生理作用尚不清楚,文中通过建立C3aR低表达的肾足细胞系(HPC-C3aRsiRNA),为研究C3aR在肾足细胞中的生理功能提供细胞模型。方法设计合成人C3aR小干扰RNA(C3aRsiRNA),将其克隆到慢病毒表达载体中,通过与包装质粒共转染293T细胞,包装成C3aRsiRNA慢病毒,利用C3aRsiRNA慢病毒感染人肾足细胞HPC,根据C3aRsiRNA慢病毒具有嘌呤霉素抗性基因的特点筛选稳定转染的人肾足细胞。通过荧光定量PCR分析稳定转染的足细胞C3aR的mRNA表达水平,Western blot和免疫组化染色分析稳定转染的肾足细胞C3aR蛋白水平,鉴定稳定转染C3aR低表达的肾足细胞系。结果荧光定量PCR结果显示,与HPC-C3aRsiRNA细胞C3aR的mRNA水平(0.26±0.04)比较,非转染HPC细胞(1.00±0.13)和阴性对照(1.07±0.16)显著升高(P<0.05)。免疫组化染色显示HPC-C3aRsiRNA细胞的C3aR蛋白水平显著降低。Western blot结果显示,与HPC-C3aRsiRNA C3aR蛋白表达(0.62±0.09)比较,正常HPC、阴性转染的HPC表达(1.00±0.08、1.00±0.22)显著升高(P<0.05)。结论成功构建了C3aR低表达的肾足细胞系,可为进一步了解C3aR在肾中的生理作用提供细胞模型。

C3AR1基因对K562细胞增殖及侵袭影响的机制研究

目的探讨C3AR1基因对慢性髓性白血病细胞株K562细胞增殖及侵袭的影响和作用机制。方法构建HL-60-C3AR1过表达的K562细胞株并使其稳转表达,通过反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)和Western blotting检测C3AR1的mRNA和蛋白表达水平,采用CCK8法检测转染后细胞的增殖,通过trans well实验评估其侵袭性,通过PCR芯片表达对比分析其可能的机制。结果 K562-C3AR1的C3AR1 mRNA表达和C3AR1蛋白表达量均显著高于K562和K562-Scramble组(P<0.05),过表达C3AR1的细胞增殖性和细胞侵袭性显著高于K562和K562-Scramble组(P<0.05),PCR芯片检测显示共有7个基因表达增高和4个基因表达下调可能参与K562-C3AR1相对K562发生增殖及侵袭的相关基因。结论本研究表明了C3AR1基因对K562细胞具有重要的调控作用,过表达C3AR1基因能促进K562细胞增殖及侵袭,其具体机制可能与DBH和EPS8等基因有关。

糖尿病肾病患者肾脏组织中C3aR、C5aR的表达

目的:探讨C3aR、C5aR在糖尿病肾病(DN)患者肾脏组织中的表达情况及其在DN发病中的作用。方法:选取DN患者的肾脏组织标本45例作为病例组,其中肾脏病理分级为Ⅰ+Ⅱ级13例、Ⅲ级21例、Ⅳ级11例;同时选取肾脏肿瘤患者手术切除的正常肾脏组织标本10例作为对照组。常规方法检测24 h尿蛋白定量、红细胞沉降率(ESR)、血肌酐(Scr)、血尿素氮(BUN)、C-反应蛋白(CRP)等指标。采用免疫组化方法检测C3aR、C5aR在各组肾脏组织中的表达。分析DN患者肾脏病理损伤级别与临床指标、肾组织中C3aR和C5aR阳性细胞百分比与临床指标的相关性。结果:C3aR和C5aR在各级DN患者肾脏组织中的表达均高于对照组,且随着DN肾脏病理损伤的加重,其表达逐渐增强(F=45.987,40.426,P均<0.001)。DN患者肾脏病理损伤级别与24 h尿蛋白定量、Scr、BUN、CRP等呈正相关(rS分别为0.529、0.595、0.516和0.425,P均<0.05);C3aR在肾脏组织中的阳性细胞百分比与24 h尿蛋白定量、Scr、BUN、CRP及ESR呈正相关(rS分别为0.342、0.613、0.489、0.315和0.321,P均<0.05)。C5aR在肾脏组织中的阳性细胞百分比也与以上指标呈正相关(rS分别为0.403、0.441、0.315、0.456和0.389,P均<0.05)。结论:C3aR、C5aR参与DN的发生与发展,在DN的病理损伤过程中起重要作用。

C3aR激动剂对小鼠原代肾小管上皮细胞表型的影响

目的细胞转分化(EMT)过程中的关键事件包括上皮细胞蛋白(E-钙黏蛋白)的表达下调,细胞活动性增加,细胞基质生成的增多等。文中构建鼠原代肾小管上皮细胞培养及鉴定的方法,探究C3aR活化是否能够引起小管上皮细胞发生上皮-间质细胞转分化。方法用鼠肾小管节段进行肾小管上皮细胞原代培养,以免疫细胞化学及免疫荧光染色对上皮细胞进行鉴定。实验分为正常对照组,C3aR激动剂设5个浓度组:0.1、1、100、500及2000 ng/m L组,另设3个时间组:6、12及24 h组。利用Real-time PCR检测肾小管上皮细胞中E-钙黏蛋白、α-SMA及collagen I的表达水平变化;利用Western blot检测E-钙黏蛋白、α-SMA蛋白表达水平;用鬼笔环肽对上皮细胞行骨架染色,观察细胞骨架形态变化。结果与正常对照组比较,C3aR激动剂组(500 ng/m L、刺激48 h)抑制E-钙黏蛋白表达[(0.950±0.901)vs(0.650±0.221),P<0.05],上调α-SMA[(1.380±0.062)vs(1.600±0.103),P<0.05]和collagen I表达(P<0.05),且各自表达趋势与C3aR激动剂呈时间和剂量依赖关系。细胞骨架染色结果显示,随着C3aR激动剂刺激时间的延长,上皮细胞内由激动蛋白构成的应力纤维生成逐渐增多。结论成功构建了小鼠肾小管上皮细胞原代培养及鉴定的方法;C3aR活化能够促进肾小管上皮细胞发生上皮-间质细胞转分化,并在肾纤维化的发生发展中起一定作用,预示C3aR可能成为肾疾病治疗的新靶点。

抑制补体C3/C3aR信号可改善新生大鼠脑生发基质出血后脑积水

目的研究补体C3/C3aR信号介导的小胶质细胞-星型胶质细胞交互作用对新生大鼠脑生发基质出血(germinal matrix hemorrhage,GMH)后脑积水的影响。方法检测胶原酶(Ⅶ-S型)诱导新生大鼠GMH后脑室周围C3和C3aR的表达。给予GMH大鼠C3aR拮抗剂(complement C3 receptor antagonist,C3aRA)处理,观察C3aRA对大鼠脑积水(MRI检查)、学习记忆功能(水迷宫实验)和炎症反应(IL-1β、IL-6、TNF-α、TGF-β1和水通道蛋白4)的影响。结果 GMH后脑室周围补体C3和C3aR表达上调,炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-α、TGF-β1表达增加,星形胶质细胞表面的水通道蛋白4异位表达且表达增加,脑室扩张,脑皮质和海马受压,大鼠学习记忆功能下降。阻断C3/C3aR信号后,相应C3、C3aR表达减低,炎症因子分泌减少,脑室扩张程度及皮层/海马受压减轻,大鼠神经功能明显改善。结论 GMH后星形胶质细胞上调并释放C3, C3与小胶质细胞表面的C3aR结合促进炎症反应,加重脑积水。星形胶质细胞表面水通道蛋白4的异位表达可能对GMH后脑积水产生起重要作用。

C3a/C3aR轴在肾脏疾病中的作用

近年来,C3a/C3aR轴在肾脏疾病中的作用逐渐受到关注,在其相关肾脏疾病患者肾组织中均能检测到C3a、C3aR的表达上调,上调程度与临床病理指标及肾脏预后显著相关。一些研究表明,C3a能通过与炎症细胞及肾脏组织细胞(肾小管上皮细胞、肾小球内皮细胞等)上表达的C3aR相结合,使靶细胞活化,释放多种炎性因子,来促进肾脏疾病的发生发展。但C3a/C3aR轴在肾脏疾病中的确切病理意义和作用机制仍有待进一步研究,本文就C3a/C3aR轴在肾脏疾病中的作用进行综述。

过表达C3aR人足细胞的构建及鉴定

目的构建过表达C3a受体(C3aR)的肾小球足细胞株,为探讨C3aR在肾小球足细胞中的确切生理和病理意义提供细胞模型。方法设计合成人C3aR表达单元,将其克隆到慢病毒表达载体p Lenti6.3-MCS-IRES2-EGFP的多克隆位点,构建成C3aR表达载体p Lenti6.3-C3aR-IRES2-EGFP;将p Lenti6.3-C3aR-IRES2-EGFP和包装质粒共转染293 T细胞,包装成C3aR表达重组慢病毒LV-C3aR;以LV-C3aR感染人肾小球足细胞系HPC,根据LV-C3aR上带有杀稻瘟菌素抗性基因的特点,以杀稻瘟菌素筛选稳定转染细胞克隆;利用荧光定量PCR和细胞免疫化学分析方法对稳定转染细胞克隆的C3aR表达水平进行分析,从中鉴定出稳定过表达C3aR的人肾小球足细胞株。结果成功构建了C3aR表达载体p Lenti6.3-C3aR-IRES2-EGFP;得到了高滴度的C3aR表达重组慢病毒LV-C3aR;成功构建了过表达C3aR的人肾小球足细胞株HPC-C3aR。结论成功构建C3aR表达载体和过表达C3aR的人肾小球足细胞株,为进一步研究C3aR过表达在人肾小球足细胞中的病理意义提供了很好的细胞模型,也为进一步开展C3aR在其他细胞中的生理、病理意义创造了条件。

白蛋白过载对阿霉素肾病小鼠肾脏C3a-C3aR信号通路及IL-17的影响

目的研究白蛋白过载对阿霉素肾病小鼠肾脏局部补体C3a-C3a受体(C3a R)信号通路及白细胞介素17(IL-17)的影响,初探白蛋白过载致肾脏损害的免疫学机制。方法 SPF级雄性Balb/c健康小鼠随机分为对照组、阿霉素肾病组(ADR组)、白蛋白过载组(ADR+BSA组)。所有小鼠行左肾切除术,第2周末构建阿霉素肾病模型,第6周末白蛋白过载组腹腔注射牛血清白蛋白(10 mg/g,5次/周,共4周)。第6、10周末检测24小时尿蛋白、血清生化指标、肾脏组织病理、Real-time PCR及免疫组化法检测肾脏C3a、C3a R、TGF-β1表达,ELISA及免疫组化法检测肾脏IL-17表达。结果第10周末ADR组肾脏C3a、C3a R、TGF-β1、IL-17表达均较对照组增高(P均<0.05)。第10周末ADR+BSA组尿蛋白、血清尿素氮水平较对照组及ADR组升高(P均<0.05);肾脏组织病理发现肾小球呈局灶节段性硬化及肾小管损害加重;肾脏C3a、C3a R、TGF-β1、IL-17表达较对照组及ADR组增高(P均<0.05)。结论阿霉素肾病小鼠肾脏局部C3a-C3a R信号通路活化,白蛋白过载致持续大量蛋白尿可进一步活化C3a-C3a R信号通路,同时上调TGF-β1、IL-17表达进而加重肾脏损害。

补体C3aR在大鼠脊髓缺血再灌注损伤中的表达

目的观察脊髓缺血再灌注损伤(SCIR)过程中大鼠脊髓C3aR的表达水平及细胞定位,探讨C3a-C3aR信号通路在SCIR病理过程中的作用。方法使用体重为250g^300g的雄性成年SD大鼠,参照Zivin法构建大鼠SCIR模型。将54只大鼠随机分为假手术组(Sham组,n=9),单纯缺血组(I组,n=9)和缺血再灌注组(IR组,n=36),缺血再灌注组又依据再灌注时间不同分为再灌注12h组(IR12h组,n=9)、再灌注24h组(IR24h组,n=9)、再灌注48h组(IR48h组,n=9)和再灌注3d组(IR3d组,n=9)。观察动物行为学改变并进行运动功能评分,评估模型是否制备成功;采用ELISA法检测SCIR过程中大鼠血浆C3a分子的表达水平;制备大鼠脊髓组织冰冻切片,采用双重标记的免疫组织荧光染色法检测SCIR过程中大鼠脊髓组织C3aR的表达变化及细胞定位。结果大鼠脊髓缺血1h及再灌注1h、6h、12h、24h和48h后出现明显的运动功能障碍;IR组大鼠血浆C3a含量较Sham组显著升高(P<0.05),其中,IR24h组大鼠血浆C3a含量最高;IR组大鼠脊髓组织C3aR表达上调,主要在神经元和小胶质细胞上表达。SCIR过程中脊髓组织小胶质细胞大量激活,小胶质细胞上高表达C3aR是C3aR表达上调的主要原因。结论 SCIR过程中C3a-C3aR信号通路激活,C3a在血浆中表达升高,C3aR在脊髓组织中表达上调,C3a-C3aR信号通路可能在SCIR病理进程中发挥着诱导炎症反应加重脊髓损伤等作用。

C3aR拮抗剂治疗PR8/MRSA共感染小鼠肺炎损伤的研究

目的补体异常激活可大量产生过敏毒素C3a分子,通过利用C3aR受体拮抗剂(C3aRa)可抑制C3a功能,达到治疗流感病毒和金黄色葡萄球菌(PR8/MRSA)共感染小鼠肺炎损伤的目的,探究一种治疗共感染重症肺炎损伤的新策略。方法PR8/MRSA共感染小鼠尾静脉注射C3aR受体拮抗剂C3aRa,剂量1 mg/kg,1次/2 d,观察记录小鼠死亡率变化;测量共感染小鼠体质量,取新鲜肺组织称重,计算肺指数;制备小鼠肺组织石蜡切片并行HE染色,观察肺部病理改变。结果经过敏毒素受体拮抗剂C3aRa干预后的共感染小鼠较对照组生存率提高了30%,肺组织充血、水肿和出血程度减轻,肺指数明显下降(P<0.001)。结论C3aRa在流感/细菌共感染重症肺炎的治疗中具有一定疗效,为临床利用补体干预治疗共感染重症肺炎提供了一种新策略。

丹酚酸A调控C3aR的表达治疗缺血性疾病作用机制研究

目的:探讨丹酚酸A(salvianolic acid A,SAA)通过调控过敏毒素C3a受体(anaphylatoxin C3a receptor,C3aR)的表达治疗缺血性疾病的作用机制。方法:构建体外血小板活化模型和中性粒细胞活化模型,采用比浊法检测血小板聚集率;流式细胞术检测血小板P选择素(P-selectin,CD62p)的表达;免疫荧光检测血小板在纤维蛋白原上的黏附;酶联免疫吸附测定法检测弹性蛋白酶(elastase,NE)、髓过氧化物酶(myeloperoxidase,MPO)、基质金属蛋白酶9(matrix metalloproteinase 9,MMP9)和乳铁蛋白(lactoferrin,LF)的水平。结果:与模型组对比,不同浓度的SAA能抑制二磷酸腺苷(adenosine diphosphate,ADP)诱导的血小板聚集、黏附、释放(P<0.05),显著抑制ADP诱导的C3aR的表达(P<0.05);与模型组对比,SAA能抑制中性粒细胞中NE、MPO、MMP9、LF的水平(P<0.05);C3aR抑制剂可抑制缺氧诱导的中性粒细胞脱颗粒(P<0.05)。结论:SAA可能通过调控C3aR的表达抑制血小板活化、聚集、黏附及中性粒细胞脱颗粒治疗临床缺血性疾病。

C3aR和晚期糖基化终产物受体对APP/PS1阿尔兹海默病小鼠模型骨代谢的影响

目的研究补体C3a受体(complement C3a receptor,C3aR)和晚期糖基化终产物受体(receptor for advanced glycation end product,RAGE)对APP/PS1阿尔兹海默病小鼠模型骨代谢的影响。方法将APP/PS1(APPswe/PS1dE9)阿尔兹海默病小鼠分别与C3aR基因敲除鼠(C3aR^(-/-))、RAGE基因敲除鼠(RAGE^(-/-))杂交产生APP/PS1-C3aR^(-/-)和APP/PS1-RAGE^(-/-)。在体内,通过微计算机断层扫描(Micro-CT)、骨组织骨钙素免疫组织化学染色、抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate-resistant acid phosphatase,TRAP)染色和Goldner三色法染色,了解不同基因型鼠之间骨代谢的差异性;在体外,通过骨髓源成骨细胞和破骨细胞诱导培养了解C3aR和RAGE对成骨细胞和破骨细胞分化的影响。结果在体内实验中,与APP/PS1小鼠相比,APP/PS1-C3aR^(-/-)和APP/PS1-RAGE^(-/-)小鼠骨量增多,骨形成增加,骨吸收减弱,类骨质增多(P<0.05)。在体外实验中,APP/PS1-C3aR^(-/-)和APP/PS1-RAGE^(-/-)小鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)成骨分化能力增强,碱性磷酸酶(ALP)、成骨转录因子2(RUNX2)表达增加,破骨细胞分化能力减弱,TRAP染色阳性减少(P<0.05)。结论C3aR和RAGE都参与调节APP/PS1小鼠骨代谢过程,敲除C3aR和RAGE可以改善APP/PS1小鼠的骨质疏松,为临床上阿尔兹海默病合并骨质疏松的治疗提供了新的靶点。

种植体周围炎炎性组织差异表达基因的筛选及验证

背景:种植体周围炎严重影响着口腔种植修复的成功,目前仍然没有有效的治愈方法,其发病机制也尚未阐明。目的:寻找种植体周围炎发生相关的核心差异表达基因,并进行实验验证。方法:利用生物信息技术从GEO数据库中筛选种植体周围炎牙龈和健康牙龈的差异表达基因,并对差异基因进行富集分析。利用String数据库构建蛋白互作网络,并使用cytoscape软件筛选关键基因,采用RT-PCR和免疫组化检测对关键基因C3AR1表达进行验证。采用RT-PCR法检测RAW264.7细胞破骨向分化后C3AR1 mRNA的表达水平。结果与结论:①将GSE33774数据集中种植体周围炎牙龈和健康牙龈的基因数据行差异分析,得到有意义的上调基因33个,下调基因17个,共50个差异表达基因;GO和KEGG结果显示差异表达基因主要富集在免疫受体活性、C-C趋化因子受体活性功能,以及破骨细胞分化相关信号通路上;②共筛选出C3AR1、CD14、TLR4、CCR1、CYBB和FCGR2A 6个关键基因,RT-PCR、免疫组化实验结果证实,C3AR1在种植体周围炎组织中表达上调,且C3AR1在巨噬细胞破骨向分化后表达上调;③结果显示,C3AR1在种植体周围炎中高表达,可能是种植体周围炎骨质破坏的关键基因。