黄芩苷抑制CA46细胞增殖和诱导凋亡的作用机制探讨

目的:研究中药黄芩苷(baicalin)对人Burkitt淋巴瘤细胞株CA46细胞增殖、凋亡的影响并探讨其可能作用机制。方法:应用MTT法绘制细胞生长曲线观察黄芩苷对CA46细胞增殖的影响;Annexin V-FITC/PI双染流式细胞术、细胞DNA片段化、TdT酶介导的原位缺口末端标记(TUNEL)法检测黄芩苷诱导CA46细胞凋亡的能力;RT-PCR法检测黄芩苷作用前后c-myc、bcl-2mRNA表达水平的变化,Western blotting法检测c-Myc、Bcl-2、procaspase-3(caspase-3前体)、PARP(多聚ADP核糖聚合酶)蛋白水平的变化。结果:细胞生长曲线结果显示黄芩苷能明显抑制CA46细胞增殖,半数抑制浓度(IC50)约为10μmol/L;Annexin V-FITC/PI双染流式细胞术早期凋亡的检出、TUNEL晚期凋亡细胞的检出和细胞DNA片段化凋亡梯带的检出,均证实黄芩苷能有效诱导CA46细胞凋亡,细胞凋亡率呈现浓度依赖性递增。黄芩苷作用后CA46细胞c-myc、bcl-2mRNA和c-Myc、Bcl-2、procaspase-3、PARP(116kD)蛋白的表达呈现时间依赖性递减,而PARP(85kD)表达呈现时间依赖性递增。结论:黄芩苷能有效抑制CA46细胞增殖,诱导其凋亡;c-Myc、Bcl-2表达水平下调和caspase-3激活可能参与了这一作用过程。

AS_2O_3逆转人恶性淋巴瘤CA46细胞系p16基因甲基化状态及激活转录的实验研究

本研究旨在探讨三氧化二砷(As2O3)逆转恶性淋巴瘤CA46细胞株p16基因甲基化状态和调节转录作用及其可能的机制。以高甲基化的恶性淋巴瘤细胞株CA46作为研究基因甲基化与表达关系的实验对象。采用SRB法检测As2O3对人恶性淋巴瘤CA46细胞系增殖、活力的影响;nMSP法检测药物作用后p16甲基化状态变化;RT-PCR法检测p16、甲基转移酶DNMT1、DNMT3A、DNMT3B mRNA的表达;利用流式细胞术DNA倍体分析法探讨As2O3对恶性淋巴瘤细胞周期的影响。结果表明:①As2O3作用CA46细胞株72小时后p16基因甲基化程度明显减弱,p16基因异常甲基化的现象被逆转;②未处理组细胞p16基因呈微弱表达,As2O3作用72小时后p16基因表达增强,0.5μmol/L组、1.0μmol/L组和2.0μmol/L组p16基因表达阳性条带与β-actin灰度的比值分别为(0.33±0.10)、(0.57±0.11)、(0.67±0.09),阳性对照灰度比值为(0.73±0.13),差异有统计学意义(p<0.01);③与未处理组相比,As2O3作用72小时后甲基转移酶DNMT3A、DNMT3B的表达下降并呈浓度依赖性,而DNMT1表达不受影响;④与对照组相比,3组不同浓度As2O3均能明显抑制肿瘤细胞生长,G0/G1期细胞增加。结论:As2O3可能通过抑制甲基转移酶DNMT3A、DNMT3B或(和)直接逆转p16基因甲基化状态,使p16基因表达上调,并恢复其活性,从而实现其细胞周期调控功能,将细胞阻滞于G0/G1期,抑制肿瘤细胞的增长。

红花桑寄生总黄酮提取物诱导淋巴瘤细胞株CA46凋亡及其分子机制研究

研究了一种寄主为夹竹桃的红花桑寄生总黄酮提取物(Nispex)对人Burkitt淋巴瘤细胞株CA46的抗肿瘤作用,探讨了其抗肿瘤作用的分子机制。应用MTT法研究Nispex对CA46细胞增殖的抑制效果,细胞集落培养法观察Nispex对CA46中增殖细胞群的影响。采用AO/EB荧光染色、TUNEL分析、DNA凝胶电泳分析以及AnnexinV流式细胞术检测细胞凋亡,Western blot检测Nispex对CA46细胞中NF-κBp65、Bcl-2、Bax、Caspase-3和PARP等蛋白表达的影响。结果表明,Nispex显著抑制CA46细胞增殖和诱导CA46细胞凋亡,作用48h的IC50值为1.72μg/mL,细胞凋亡率与药物浓度正相关。Nispex能有效上调CA46细胞Bax、Caspase-3蛋白表达,下调NF-κBp65、Bcl-2、PARP蛋白表达。Nispex诱导CA46细胞凋亡可能是通过对NF-κB信号通路的抑制来实现的。

雷公藤内酯醇逆转人恶性淋巴瘤CA46细胞系p16基因甲基化的实验研究

目的:以p16基因存在异常甲基化的恶性淋巴瘤细胞CA46为研究对象,探究雷公藤内酯醇(triptolide,TPL)对P16这一细胞周期调控中的重要基因的影响,并对其机制进行初步探讨。方法:①运用四甲基偶氮唑盐(MTT)法等检测triptolide对CA46细胞株增殖的影响。②巢式甲基特异性PCR检测triptolide对CA46细胞p16基因甲基化模式的影响。③半定量RT-PCR检测经triptolide作用后CA46细胞p16基因mRNA的表达。结果:Triptolide对CA46细胞生长有明显的抑制作用,并有时间及剂量依赖性,48小时IC50为28.8ng/ml;triptolide可逆转P16基因的高甲基化;triptolide能够诱导CA46细胞p16基因mRNA的表达,具剂量依赖性。结论:小剂量triptolide可明显抑制CA46细胞的增殖,其可能机制为通过诱导CA46细胞中异常甲基化的p16基因去甲基化,使p16基因恢复表达,从而对细胞周期起负调控作用。

表没食子儿茶素没食子酸诱导人恶性淋巴瘤CA46细胞系p16基因去甲基化及转录

本研究旨在探讨表没食子儿茶素没食子酯酸(epigallocatechin-3-gallate,EGCG)诱导人恶性淋巴瘤CA46细胞系p16基因去甲基化及转录激活的可能机制。以生长曲线、MTT法检测EGCG对CA46细胞生长和增殖的抑制作用;利用流式细胞仪DNA含量分析法探讨EGCG对CA46细胞周期的影响;采用巢式甲基特异性PCR法(nested-methylation specific PCR,n-MSP)及DNA克隆测序分析法检测EGCG作用前后CA46细胞p16基因甲基化状态;应用RT-PCR检测p16、DNA甲基转移酶(DNMT3A、DNMT3B)基因mRNA的表达。结果表明:与对照组相比,3组不同浓度EGCG均能明显抑制CA46细胞生长,G0/G1期细胞增加;不同浓度EGCG作用48小时后p16基因甲基化程度减弱;未处理组细胞p16基因呈微弱表达,未用药组、不同浓度EGCG(6、12、24)μg/ml处理组条带灰度值与β-actin1比值分别为(0.05±0.01)、(0.19±0.03)、(0.39±0.10)、(0.85±0.09),各处理组p16基因mRNA表达明显高于未用药组,其差异有显著意义(p<0.05);与对照组相比,EGCG作用48小时后CA46细胞甲基转移酶DNMT3A、DNMT3B mRNA的表达均下降。结论:EGCG可能通过抑制甲基转移酶DNMT3A、DNMT3B和(或)直接对p16基因去甲基化,使p16基因mRNA表达上调,恢复其活性,从而实现其对细胞周期的调控功能,将细胞阻滞于G0/G1期,抑制CA46细胞的增殖。

黄芩苷对CA46细胞裸鼠异种移植瘤的作用及机制

目的:研究黄芩苷抗CA46细胞裸鼠异种移植瘤的作用并探讨其机制。方法:构建CA46细胞裸鼠异种移植瘤模型,将荷瘤裸鼠随机分为5组:阴性对照组、15 mg/kg黄芩苷组、30 mg/kg黄芩苷组、60 mg/kg黄芩苷组和4 mg/kg依托泊甙(VP-16)阳性对照组。采用腹腔注射方式给药,12 d后处死部分裸鼠,对剥取的瘤块称重计算抑瘤率,并进行透射电镜、病理学和Western blotting检测;观察各组未处死的裸鼠直至全部死亡,研究黄芩苷对荷瘤裸鼠生存时间的影响。结果:黄芩苷明显抑制了CA46细胞裸鼠异种移植瘤的生长,引起肿瘤细胞的凋亡、坏死以及p-Akt、NF-κB、mTOR和p-mTOR蛋白表达的下调;随着黄芩苷剂量的增加,黄芩苷治疗组荷瘤裸鼠的生存时间明显延长。结论:黄芩苷可抑制CA46细胞裸鼠异种移植瘤的生长,诱导肿瘤细胞的凋亡,并延长荷瘤裸鼠的生存时间,其机制可能与下调PI3K/Akt/NF-κB和PI3K/Akt/mTOR信号通路有关。

CD40发夹siRNA真核表达载体构建及其对CA46细胞CD40表达的影响

目的: 构建人类CD40膜蛋白siRNA的真核表达载体, 观察其对CA46细胞上CD40表达、细胞增殖能力和凋亡的影响。方法: 合成两条编码发夹siRNA序列的单链DNA,并将其克隆到pSilenCircle载体中, 构建含目的基因片段的重组质粒siCD40 /pSilenCircle。以同样的方法, 分别构建相对应的编码反义RNA及无关基因的重组质粒antiCD40 /pSilenCir cle和siFly/pSilenCircle。以上述重组质粒分别瞬时转染CA46细胞后, 用流式细胞仪检测CA46细胞上CD40的表达和细胞凋亡情况, 用MTS法(改良的MTT法)测定细胞的增殖能力。结果: ①成功地构建了两个CD40发夹siRNA的真核表达载体siCD40 /pSilenCircle、两个相对应的反义RNA真核表达载体antiCD40 /pSilenCircle和无关基因重组质粒siFly/pSilenCir cle。②与siFly/pSilenCircle转染组相比较, siCD40 /pSilenCir cle转染组和antiCD40 /pSilenCircle转染组CA46细胞上CD40的表达均明显减少, 但细胞的增殖能力和凋亡未发现明显变化。结论: 构建的两个CD40发夹siRNA的真核表达载体siCD40 /pSilenCircle, 可有效地抑制CA46细胞上CD40分子的表达, 但不影响细胞的增殖和凋亡。RNA干扰技术可望作为一种有效地调控基因功能的方法。

辛伐他丁对淋巴瘤CA46细胞凋亡的影响及机制

目的:研究内源性胆固醇合成限速酶(HMG-CoA)还原酶抑制剂辛伐他汀对淋巴瘤细胞凋亡的影响及分子机制。方法:辛伐他汀对淋巴瘤CA46细胞株进行干预,MTT法评价二者对癌细胞增殖的影响;流式细胞计量术检测细胞凋亡;免疫印迹法检测凋亡相关蛋白多聚ADP核糖多聚糖蛋白(PARP)、半胱氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)、凋亡相关基因Bax、Bcl-2表达情况。结果:辛伐他汀干预可显著抑制CA46细胞MTT活性,辛伐他汀作用还可促进CA46细胞凋亡的启动,且均呈剂量-效应关系;辛伐他汀干预还可引发CA46肿瘤细胞Caspase-3活性水平升高,PARP裂解失活,促凋亡蛋白Caspase-3、Bax高表达,抗凋亡蛋白Bcl-2表达降低,且均呈现时间-效应关系。结论:辛伐他汀对淋巴瘤CA46细胞具有增殖抑制和促凋亡效应,其机制可能与caspase家族介导的蛋白酶级联反应、PARP裂解失活以及Bcl-2家族介导的细胞色素C途径有关。

Bcl-2 siRNA对淋巴瘤细胞系CA46凋亡的影响

本研究探讨bcl-2 siRNA对淋巴瘤细胞系CA46凋亡及bcl-2基因表达的影响。设计并合成1条siRNA,用阳离子脂质体法转染CA46细胞。转染后48小时收集CA46细胞,用流式细胞仪检测细胞凋亡及凋亡过程中线粒体跨膜电位改变,用RT-PCR方法和流式细胞仪分别检测CA46细胞bcl-2 mRNA和BCL-2蛋白的表达。结果表明:bcl-2 siRNA转染CA46细胞48小时后,CA46细胞出现凋亡且线粒体跨膜电位发生变化;bcl-2 mRNA和BCL-2蛋白表达均显著降低。结论:bcl-2 siRNA可特异性抑制淋巴瘤细胞CA46 bcl-2基因的表达,改变CA46细胞线粒体跨膜电位诱导其凋亡。

硼替佐米对淋巴瘤细胞系CA46的作用及机制研究

本研究探讨硼替佐米(bortezomib,BZM)对淋巴瘤细胞系CA46的作用及相关机制。采用MTT法观察BZM对CA46细胞增殖的作用,流式细胞术分析BZM对CA46细胞凋亡的影响,Western blot法检测经BZM作用的CA46细胞procaspase-3、BCL-2蛋白表达水平。结果表明,BZM能明显抑制CA46细胞增殖,24小时和48小时的半数抑制浓度(IC50)分别为53.19,19.68nmol/L;BZM能诱导CA46细胞凋亡,且呈现剂量和时间依赖性;20nmol/LBZM处理CA46细胞不同时间后procaspase-3、BCL-2蛋白表达呈时间依赖性降低。结论:BZM可以抑制CA46细胞增殖,诱导其凋亡,其机制可能涉及了BCL-2表达下调及caspase-3的活化。

CD40发夹siRNA真核表达质粒与siRNA表达框架对CA46细胞CD40表达的影响

目的构建人类CD40膜蛋白siRNA真核表达质粒,观察其能否抑制CA46细胞CD40表达。方法合成2条编码发夹siRNA序列的单链DNA,克隆到pSilenCircle载体中,构建成含目的基因片段的重组质粒———siCD40/pSilenCircle,在polⅢU6基因启动子控制下表达siRNA。同样方法构建相对应的编码反义RNA以及无关基因的重组质粒antiCD40/pSilenCircle和siFly/pSilenCircle,以作比较和对照。PCR制备CD40-SECs(CD40-siRNA表达框架)。以脂质体FuGene 6为介质瞬时转染CA46细胞,利用流式细胞技术检测细胞膜CD40的表达。结果(1)成功构建了CD40发夹siRNA真核表达质粒siCD40/pSilenCircle、CD40反义RNA真核表达质粒antiCD40/pSilenCircle和无关基因重组质粒siFly/pSilenCircle;(2)PCR成功制备CD40-SEC;(3)与siFly/pSilenCircle转染组相比较,siCD40/pSilenCircle、antiCD40/pSilenCircle和CD40-SEC转染组的CA46细胞CD40的表达均明显减少。结论CD40发夹siRNA真核表达质粒siCD40/pSilenCircle和CD40-SEC可有效地抑制CA46细胞CD40分子的表达。RNA干扰技术可望作为一种有效的调控基因功能的工具。

黄芩苷衍生物02-036对Burkitt淋巴瘤CA46细胞株的作用及相关机制

目的:探讨黄芩苷(Baicalin)衍生物02-036对人Burkitt淋巴瘤CA46细胞株的增殖、凋亡的影响及其相关机制。方法:应用MTT法检测和绘制细胞生长曲线;细胞集落形成实验检测黄芩苷衍生物02-036对CA46细胞增殖的影响;AnnexinV-FITC/PI双染流式细胞术检测02-036对细胞凋亡的影响;DNA倍体分析(DNA ploidy analysis)检测02-036对细胞周期的影响;Western blot检测增殖及凋亡相关蛋白BCL-2、Procaspase-9、Procaspase-3、PARP和C-MYC表达水平。结果:细胞生长曲线结果显示黄芩苷衍生物02-036对CA46细胞株有明显的抑制增殖作用,并且呈量效和时效关系(r=0.963,r=0.992),48 h半数抑制浓度(IC50)为(6.04±0.11)μmol/L。细胞集落形成实验显示,02-036作用CA46细胞后,细胞集落形成能力明显降低,并在一定范围内呈量效关系(r=-0.967)。Annexin V-FITC/PI双染流式细胞术分析结果表明,02-036能有效诱导CA46细胞凋亡,并且在一定范围内,细胞凋亡率随着药物作用浓度的增高而增加(r=0.959)。DNA倍体分析检测显示02-036能将CA46的细胞周期阻滞于S期。不同浓度的02-036作用于CA46细胞后,BCL-2、Pro-caspase-9、Pro-caspase-3、PARP和C-MYC的表达逐渐下调,而Cleaved-PARP表达逐渐上调,并呈现量效关系(r值分别为-0.990、-0.939、-0.971、-0.967、-0.936和0.920)。结论:黄芩苷衍生物02-036能有效抑制CA46细胞增殖,诱导其凋亡,在一定范围内呈时效和量效关系;其作用机制可能与BCL-2、Pro-caspase-9、Pro-caspase-3、PARP及C-MYC的表达下调有关。

核仁素通过调控胸苷激酶1影响淋巴瘤增殖的研究

目的:探讨核仁素通过胸苷激酶1(TK1)参与淋巴瘤增殖调控的机制。方法:选取弥漫性大B细胞淋巴瘤患者23例,纳入初治组14例,复发/难治组9例,检测患者血清TK1以及外周血单个核细胞中C23蛋白。以Burkitt淋巴瘤细胞株CA46为研究对象,通过慢病毒介导的转染方法,获得RNAi核仁素基因表达下调的细胞模型CA46-NCL-KD及阴性对照组细胞模型CA46-NCL-KNC;采用细胞增殖法(MTS法)分别检测CA46-NCL-KD、CA46-NCL-KNC和CA46对阿霉素的增殖半数抑制率(IC_(50))。通过Q-PCR和Western blot分别检测CA46-NCL-KD、CA46-NCL-KNC细胞NCL mRNA和蛋白表达水平,用流式细胞术对CA46-NCL-KD、CA46-NCL-KNC和CA46细胞进行细胞周期检测,用酶免疫点印记化学发光法分析CA46-NCL-KD、CA46-NCL-KNC细胞TK1蛋白的表达情况。结果:初治组患者血清TK1水平为0.43(0.30-1.01)pmol/L,低于复发/难治组患者的10.56(2.19-14.99)pmol/L(P<0.01),且初治组患者外周血单个核细胞NCL蛋白相对表达量明显低于复发/难治组。CA46-NCL-KD对阿霉素的IC_(50)为(0.147±0.02)μg/ml,明显低于CA46-NCL-KNC的(0.301±0.04)μg/ml以及CA46的(0.338±0.05)μg/ml(P<0.05);与CA46-NCL-KNC相比,CA46-NCL-KD中NCL mRNA和蛋白水平表达下降,细胞周期中的G0/G1期比例升高,S期及G2/M期比例下降,TK1蛋白表达下降。结论:在弥漫大B细胞淋巴瘤细胞以及淋巴瘤细胞株CA46细胞中NCL表达升高,提示细胞对药物敏感度降低,NCL可能通过影响TK1表达参与淋巴瘤细胞增殖的调控,从而影响淋巴瘤细胞对药物的敏感性。

四种恶性血液病细胞系的Id4基因启动子甲基化

本研究探讨4种白血病和淋巴瘤细胞系以及非肿瘤细胞系和正常人骨髓Id4基因启动子甲基化状态及其差异。采用甲基化特异性聚合酶链反应(MS-PCR)对白血病细胞系K562和HL-60、淋巴瘤细胞系Ramous和CA46以及良性细胞系Hek937和正常人骨髓细胞进行Id4基因甲基化状态检测。结果表明:Id4基因在正常人骨髓细胞和Hek937细胞系中呈完全非甲基化状态,在4个血液肿瘤细胞系K562、HL-60、Ramous和CA46中均呈甲基化状态。结论:所检测的4种血液肿瘤细胞系中,Id4基因的甲基化状态与正常人骨髓细胞和非肿瘤细胞系完全不同,Id4基因甲基化模式的改变与造血细胞恶变的发生密切相关。

用携有存活蛋白基因的重组腺病毒载体转染树突状细胞诱导细胞毒T细胞抗淋巴瘤免疫效应

本研究探讨转染survivin(SVV)基因的树突状细胞(DC)体外诱导特异性抗淋巴瘤的免疫效应。对人外周血DC进行诱导培养,以Ad-SVV转染DC,用Westernblot鉴定Survivin的表达,用乳酸脱氢酶(LDH)释放法检测细胞毒性T淋巴细胞(CTL)反应,用混合淋巴细胞反应(MLR)测定DC刺激同种异体淋巴细胞增殖的能力,以ELISA法检测上清中的细胞因子IL-12含量。结果表明:在MLR中,刺激应答比(S/R)为1∶5、1∶10、1∶50和1∶100时,转染Ad-SVV的DC有较强刺激同种异体淋巴细胞增殖的能力;转染Ad-SVV的DC组所诱发的CTL活性明显高于对照DC组;转染病毒后第2天,转染Ad-SVV的DC组的IL-12分泌水平高于对照DC组。结论:含存活蛋白基因的DC能够在体外诱导特异性CTL效应,对CA46细胞有明显的杀伤作用。

ZnPcH1-PDT对淋巴瘤细胞杀伤作用的实验研究

本研究探讨新型酞菁类光敏剂ZnPcH1介导的光动力疗法(ZnPcH1-PDT)对淋巴瘤细胞的杀伤作用及其机制。采用人Burkitt淋巴瘤CA46细胞、鼠淋巴瘤P388细胞作为研究对象。应用MTT比色法和细胞集落形成实验检测PDT对细胞的杀伤作用,采用AO/EB荧光染色法、DNA片段化分析、TUNNEL、Annexin-V-FITC/PI双染等方法分析细胞的死亡方式。结果表明:ZnPcH1-PDT对人和鼠淋巴瘤细胞均有杀伤作用,且呈量效关系,但CA46细胞对PDT的敏感程度低于P388细胞(p<0.05)。PDT能够诱导细胞凋亡,且呈时间依赖性。Annexin-V-FITC/PI双染法检测还显示PDT作用后CA46细胞以早期凋亡为主,P388细胞则以早期凋亡和坏死为主。结论:ZnPcH1-PDT能够有效地抑制淋巴瘤细胞增殖,诱导细胞凋亡。

可溶性CD40配体对非霍奇金淋巴瘤细胞的影响及相关机制

目的:探讨可溶性CD40配体(sCD40L)对人非霍奇金淋巴瘤细胞增殖、凋亡及细胞周期的影响及其可能机制。方法:用不同浓度的sCD40L处理非霍奇金淋巴瘤CA46细胞和Raji细胞48 h,用CCK-8检测细胞增殖;流式细胞术检测细胞凋亡和周期;通过蛋白免疫印迹检测PTEN、BCL-2和BAX的表达。结果:与对照组比较,4和8μg/ml的sCD40L均能显著抑制Raji细胞和CA46细胞的增殖(P<0.05)。流式细胞术检测凋亡和细胞周期结果显示,4μg/ml的sCD40L能显著促进CA46和Raji细胞的凋亡和减少S期细胞的比例(P<0.05);蛋白免疫印迹结果显示,sCD40L能显著促进PTEN和BAX的表达,抑制BCL-2的表达(P<0.05)。结论:sCD40L抑制淋巴瘤细胞的增殖并促进其凋亡可能是通过调控PTEN信号通路实现。

刻录机向“4速”进军

今年8～9月份,我国刻录机市场价格狂跌不止,单台售价跌率高达22％。经过一段时间的价格混战,刻录机市场终于迎来了“和平时期”。据商家推算,目前市场上购买刻录机的用户95％以上是企业或行业用户,刻录机进入家庭的还是为数甚少。从当前市场上刻录机的读写速度不难发现,“4速”刻录机已经形成主流,“2速”