利用瞬时表达技术分析小麦抗白粉病相关基因CAF1、BI-1和DAD1的功能

利用小麦离体叶片瞬时表达技术分析了3个小麦抗白粉病相关基因CAF1、BI-1和DAD1的功能。根据小麦响应白粉菌侵染的差异表达基因芯片检测结果,筛选出表达差异的抗病相关基因CAF1和BI-1,并挑选与植物程序性死亡相关的基因DAD1,将克隆到的这3个小麦基因全长ORF序列构建入超表达载体pAHC25中,利用瞬时表达技术检测目标基因和GUS基因共转化的阳性小麦叶片表皮细胞中白粉菌成功侵入并形成吸器的细胞比例(侵入频率),研究目标基因的超表达后对白粉菌入侵及吸器形成产生的影响。结果表明,小麦CAF1基因在感病小麦品种叶片中的瞬时表达,对白粉病侵入和吸器形成具有一定的抑制作用(侵入频率为(37.37±3.2)%,对照为(54.75±0.6)%),在一定程度上增强了表达细胞对白粉菌的抗性;表达DAD1基因则可能在一定程度上有利于白粉菌吸器的形成(侵入频率为(57.34±1.1)%,对照为(50.93±1.3)%);而在感病叶片中表达基因BI-1对白粉菌吸器形成没有明显影响(侵入频率为(54.31±1.7)%,对照为(52.37±1.8)%)。

MicroRNA引起mRNA降解关键核酸酶CAF1和POP2的生物进化分析

MicroRNA(miRNA)参与调控高等真核生物中三分之一以上基因的表达,其中核酸酶CAF1(CCR4-associated factor 1)及其同源基因POP2在miRNA引发的mRNA 3′端多聚腺苷酸(poly(A))的脱腺苷酸化过程中起了关键作用.通过实时定量RT-PCR的方法检测了小鼠各个组织中CAF1和POP2的相对表达情况,发现CAF1和POP2的组织分布特征不同.大多数组织中CAF1的表达水平明显高于POP2,并且组织间差异很大,特别是在大脑、小脑以及睾丸组织中CAF1的表达量很高,而POP2的表达量和变化幅度都较低.蛋白质序列比对发现,CAF1和POP2是一类进化过程中高度保守的核酸外切酶,在酵母、线虫、果蝇和尾索动物代表物种海鞘中都只存在单一基因,而进化到鱼类后产生了两个同源基因——CAF1和POP2,其中CAF1的氨基酸序列保守性较POP2更高,更加接近于原始的单一序列.CAF1和POP2这一对同源基因氨基酸序列的主要差别在蛋白质的C端.鱼类中POP2的C端序列同CAF1的序列较为接近,而在爬行动物之后POP2产生了与CAF1具有明显差异的C端序列,并逐渐趋于稳定.我们的分析结果同已有的功能研究一致,表明可能在miRNA产生后的进化过程中产生了CAF1和POP2两个同源基因,其中CAF1主要担负miRNA调控mRNA脱腺苷酸化的功能,而POP2可能主要参与其它不同的调控作用。

鼠疫耶尔森菌caf1基因缺失株体外生物学特性和对小鼠致病性分析

目的探索caf1基因缺失对鼠疫耶尔森菌体外生物学特性与对小鼠致病性的影响.方法利用CRISPR/Cas12a介导的基因编辑技术构建鼠疫耶尔森菌caf1基因缺失株,并通过PCR技术对caf1基因缺失验证.比较鼠疫耶尔森菌caf1基因缺失株和野生株201在生长速率、液体培养状态、聚集情况等体外生物学特性和对小鼠致病性等方面的差异.结果PCR扩增结果证实,caf1基因缺失株构建成功.体外生物学特征分析表明,与野生株相比,caf1基因缺失株的形态学和生长速率并未发生明显变化,自凝聚率升高.肺递送途径LD50分析表明,caf1的缺失导致鼠疫耶尔森菌气溶胶感染小鼠半数致死剂量显著降低.结论不同途径感染结果表明,caf1基因缺失株相较于野生株,在肺递送、滴鼻、皮下、尾静脉注射4种途径下对BALB/c小鼠的毒力均降低.caf1基因的缺失导致鼠疫耶尔森菌自凝聚率升高,对BALB/c小鼠致病性下降.

烟草CAF1基因的克隆与原核优化表达

CAF1基因在植物的发育和抗逆性方面起到特定的作用。本研究旨在通过对烟草中CAF1基因进行克隆与原核表达分析,为研究其代谢机制提供数据支持。我们从野生烟草中提取总RNA,通过RT-PCR克隆获得CAF1的cDNA序列,NCBI登录号为KJ003855,生物信息学分析表明,CAF1 ORF长为855 bp,编码285个氨基酸,亚细胞定位于细胞核,其编码的CAF1蛋白仅有1个高度保守结构域:CAF1 superfamily(16~284);构建p ET30a-CAF1原核表达载体,转化到E.coli BL21(DE3)中,获得浓度为0.213 mg/mL、纯度90%,且与预期一致的28 kD蛋白质。目的蛋白的成功表达为进一步研究CAF1在抗病、抗虫功能提供理论参考和数据支持。

不同方式重组表达鼠疫caf1M蛋白的研究

目的对比不同方式克隆表达鼠疫耶尔森氏菌caf1M蛋白的存在状态及免疫学活性。方法分别选择3种不同载体pET32a(+)、pGEX4t-1、pGBTNH,克隆表达鼠疫caf1M蛋白;并以鼠疫菌免疫血清分别检测其免疫学活性。结果成功构建了4个重组质粒,分别是含去除信号肽编码序列caf1M基因的3个质粒载体,及1个含有完整caf1M基因的pGEX4t-1表达质粒;4个质粒经诱导均在大肠杆菌中得到高效表达;存在状态分析表明,含有去除信号肽编码序列caf1M基因的pGEX4t-1表达的重组蛋白以可溶方式存在,其余3种以包涵体形式存在;重组蛋白与鼠疫菌免疫血清的Western blot分析表明,除pGBTNH表达的蛋白存在非特异反应外,其余3种重组蛋白都发生特异性反应。结论成功克隆表达了4种鼠疫菌caf1M蛋白,其中3种具有良好的特异性免疫反应性;信号肽序列及载体都对重组caf1M蛋白的表达有影响。

鼠疫耶尔森氏菌caf1和pH6基因的原核表达

目的利用DNA重组技术,在大肠杆菌中获得融合表达的鼠疫耶尔森氏菌caf1及p H6抗原基因。方法利用分子克隆技术克隆后,在原核系统中表达鼠疫菌重要功能蛋白caf1及p H6蛋白,根据云南玉龙菌株(D106004)全基因组序列设计引物,PCR扩增目的基因片段;采用p ET-32a(+)作为表达载体,通过双酶切和连接反应,将目的基因片段定向插入载体中,构建重组表达质粒;IPTG诱导,使重组质粒在其宿主菌E.coli BL21(DE3)中表达。结果根据酶切鉴定和PCR产物测序结果显示,目的基因caf1及p H6已成功连接到表达载体p ET-32a(+)上,SDS-PAGE结果显示表达产物的相对分子质量约为34.2 ku和35.5 ku,与理论分子量一致。结论成功克隆并构建了p ET32a-caf1及p ET32a-p H6重组基因原核表达系统,为鼠疫潜在诊断靶点及新型疫苗选择的可能性奠定了基础。

caf1基因为靶标的鼠疫检测PCR法的改进

目的查明行业标准推荐caf1基因引物（简称行标caf1引物）进行PCR检测时，在一些非鼠疫菌上出现非特异性条带的原因，并提出解决办法。方法共选取112株菌进行试验，其中鼠疫菌40株、非鼠疫菌72株；提取菌株DNA，并对caf1基因进行PCR扩增；选择出现非特异性条带的7株菌株，进行切胶回收、纯化以及TA克隆测序；针对caf1基因重新设计引物，对被试菌株进行验证。结果使用行标caf1引物扩增40株鼠疫菌，均未出现非特异性条带，扩增72株非鼠疫菌，有58株扩增出400、500、600、700、800、900、1 000 bp的非特异性条带。经克隆和测序，在非特异性产物的基因序列中均出现行标caf1引物的反向引物序列及反向引物的反向互补序列。重新设计caf1引物，扩增72株非鼠疫菌，均未出现非特异性条带。结论行标caf1引物在筛查鼠疫菌时会出现非特异性条带，使用新caf1引物可有效避免这一情况，提高检测的准确性。

Crystal structures of human BTG2 and mouse TIS21 involved in suppression of CAF1 deadenylase activity

BTG2 is the prototypical member of the TOB family and is known to be involved in cell growth, differentiation, and DNA repair. As a transcriptional co-regulator, BTG2

鼠疫一体系双重荧光定量PCR检测方法的建立及评价

本研究根据鼠疫耶尔森氏菌caf1及YPO0392基因,设计特异性的引物和不同荧光标记的TaqMan荧光探针,构建一体系的检测体系,对其敏感性、特异性和稳定性进行评价,并对8份鼠疫阳性及24份阴性DNA样本进行应用评价。结果显示,一体系双重检测鼠疫DNA的敏感度为17.93×10^-5 ng/μL;19份鼠疫菌DNA都有扩增,25份非鼠疫菌DNA都未扩增;对8份阳性现场DNA样本进行检测,一体系检测结果均为阳性;对24份阴性DNA样本进行检测,结果均为阴性。结果表明,本研究成功建立了可同时检测鼠疫耶尔森氏菌caf1和YPO0392基因的一体系双重荧光定量PCR方法,具有良好的敏感性与特异性,操作方便并节约成本,能够代替单基因检测方法。

The Arabidopsis homologs of CCR4-associated factor 1 show mRNA deadenylation activity and play a role in plant defence responses

在真核细胞的房间的送信人 RNA (mRNA ) 周转以弄短开始 poly 在 3 鈥 ? 结束的(A) 尾巴，一个过程叫了 deadenylation。在酵母， deadenylation 反应被 CCR4 和联系 CCR4 的因素主要调停 1 (CAF1 ) ，描述得好的蛋白质建筑群的二个部件 CCR4 不说出。我们这里报导那 AtCAF1a 和 AtCAF1b，酵母 CAF1 基因的通常认为的 Arabidopsis 相当或相同的事物，部分面对咖啡因或在高温度补充酵母 caf1 异种的生长缺点。AtCAF1a 和 AtCAF1b 的表示被多重压力相关的荷尔蒙和刺激导致。在 vitro 的 AtCAF1a 和在预言的活跃地点的点变化破坏这项活动。破坏 AtCAF1a 或 AtCAF1b 的表示的 T-DNA 插入异种在压力相关的 mRNAs 的 deadenylation 是有缺点的，显示二 AtCAF1 蛋白质涉及在 vivo 的调整 mRNA deadenylation。有趣地， AtCAF1a 和 AtCAF1b 表演的单个、双的异种减少了表示致病相关( PR )基因 PR1 和 PR2 并且更产生 Pseudomonas syringae pv 西红柿 DC3000 ( Pst DC3000 )感染，而转基因的植物过去表示的 AtCAF1a 表演提高了 PR1 和 PR2 的表示并且增加了抵抗到一样的病原体。我们的结果在到病原体感染的调整 mRNA deadenylation 和防卫回答建议 AtCAF1 蛋白质的角色。

PCR检测鼠疫菌种中F1抗原基因

目的应用PCR检测试验用EV菌株是否存在caf1基因。方法应用含内部对照PCR技术,以鼠疫菌特异基因caf1合成一对引物,进行PCR实验。结果该试验用EV菌株经PCR扩增,呈现一条与caf1基因分子量相吻合的清晰目的扩增带。结论该试验用EV菌株未缺失产生F1抗原的基因,可以用于提取F1抗原等试验。

鼠疫耶尔森菌pla抗原基因芯片检测法的验证

目的检验鼠疫耶尔森菌pla抗原基因芯片检测法的准确性。方法针对鼠疫耶尔森菌pPCP1质粒上pla抗原基因中保守性片段,设计合成探针,制备尼龙膜基因芯片,用于检测在镇赉国家级鼠疫监测点采集到的达乌尔黄鼠肺、肝、肾样本154份,然后用鼠疫caf1基因PCR扩增法复检基因芯片阳性样品。结果基因芯片共检测出18份样本呈阳性反应,而caf1基因PCR法却发现这些样品均为阴性。结论在鼠疫耶尔森菌pPCP1质粒上的pla抗原基因不易用于鼠疫耶尔森菌的特异性检测,该抗原可同其它特异性抗原联合应用,提高检测的准确性。

染色质组装因子1,b亚单位在急性髓系白血病细胞中的表达研究

目的探讨染色质组装因子1,b亚单位(chromatin assembly factor1,subunitb,CAF1b)在急性髓系白血病(AML)中的表达情况及其特异性。方法建立流式细胞术检测胞内蛋白的方法,测定AML细胞株KG1a及正常人、特发性血小板减少性紫癜(ITP)、AML、急性淋巴细胞白血病(ALL)、慢性粒细胞白血病慢性期(CML-CP)、多发性骨髓瘤(MM)患者的骨髓单个核细胞中CAF1b的表达情况,利用WinMDI2.9软件分析流式数据,并行统计分析,比较之间的差异。结果 AML患者骨髓单个核细胞和KG1a细胞CAF1b的表达率分别为(21.40±2.91)%、(27.87±1.48)%,均明显高于正常人、ITP、ALL、CML-CP、MM患者(P均<0.05)。结论 CAF1b在AML有核细胞中表达特异性增高,提示其可能为AML特异性肿瘤抗原。

人抗增殖蛋白Tob与其配体蛋白的相互作用及功能研究

抗增殖蛋白Tob作为BTG/TOB家族成员之一,对细胞增殖与mRNA降解具有重要作用.在磷酸激酶Erk1和Erk2的作用下,Tob中的3个丝氨酸位点可以进行磷酸化.已有大量研究表明Tob通过与去腺苷酸化酶中的核糖核酸酶D家族成员之一的Caf1相互作用于mRNA 3′端,共同组成去腺苷酸化酶复合体.同时,Tob对胞质多聚腺苷酸化因子结合蛋白3(CPEB3)对蛋白表达的负调控具有抑制作用.并且,Tob可以与多聚腺苷酸结合蛋白(PABP)相互作用,促进细胞内mRNA脱腺苷化.通过对Tob的3个参与磷酸化的丝氨酸位点进行突变,分别研究了人源野生型与丝氨酸突变型Tob对其与人源Caf1,PABP及CPEB3相互作用及多聚腺苷酸降解过程的影响.