鸭骨骼肌早期发育过程中钙蛋白酶3(CAPN3)基因的表达及其与肌纤维性状的关联

本研究选择生长速度不同的高邮鸭和金定鸭为试验材料,对不同品种鸭胚胎期和出雏早期肌肉中钙蛋白酶3(calpain3,CAPN3)基因的表达及其与肌纤维性状的关联性进行了研究。采用实时荧光定量PCR方法研究鸭13、17、21、25、27胚龄和出雏后7日龄胸肌和腿肌中CAPN3基因表达的发育性变化。结果发现,CAPN3mRNA在2个品种鸭早期肌肉发育中具有相似的表达模式,并表现出显著的时间特异性,而品种和性别效应并不显著。在胸肌中,呈现先下降后上升的趋势,25胚龄前表达量均较低,21胚龄最低,出雏前(27胚龄)至7日龄表达量显著上升。在腿肌中,呈现"波浪形"表达模式,在21胚龄表达量最高。腿肌CAPN3基因表达与肌纤维类型、直径、面积和密度之间呈现不同程度的线性相关,部分指标在金定鸭中达到了显著水平。初步推测,CAPN3基因与肌纤维类型和肌纤维的生长发育密切相关。

牦牛CAPN3基因的克隆及组织表达特异性

以牦牛背最长肌为材料,采用RT-PCR法克隆了CAPN3基因的CDs区,并对其进行生物信息学分析。结果表明,牦牛CAPN3基因的CDs区长2 469 bp,编码822个氨基酸残基;生物信息学分析显示,其编码的蛋白属于非分泌表面蛋白,含有35个磷酸化位点,主要在细胞质和细胞核中发挥生物学作用。二级结构主要由α-螺旋、无规则卷曲、伸展链和β-转角组成,具有Cys Pc、calpain-Ⅲ和EFh家族蛋白结构域,无信号肽。牦牛CAPN3基因与黄牛、绵羊和猪在系统发育树上的距离最近。运用实时荧光定量分析CAPN3在不同组织中的表达量,CAPN3基因在牦牛的7种组织中均有表达,但在背最长肌、胰脏中的表达量较高。

藏猪和杜洛克猪CAPN3基因表达差异及其与肉质性状相关性分析

为了揭示脂肪型的藏猪和瘦肉型的杜洛克猪肌肉生长及嫩度相关基因的表达差异,采用QRT-PCR方法检测了两猪种背最长肌中钙蛋白酶3(CAPN3)基因在180日龄的表达差异,分析其表达与肌纤维面积(CSA)、肌肉剪切力的相关性。结果表明,180日龄藏猪CAPN3 m RNA表达量显著高于杜洛克猪(P<0.05)。相关性分析结果显示,CAPN3 m RNA表达量与肌纤维面积、剪切力均呈显著负相关(P<0.05)。以上结果初步揭示了两猪种在180日龄CAPN3基因表达的品种差异,为深入研究猪肌肉生长及剪切力的调控机制提供了基础数据。

牦牛CAPN3基因CDS区克隆及生物信息学分析

根据GenBank中普通牛CAPN3基因cDNA序列,设计特异性引物,采用RT-PCR技术从牦牛总RNA中克隆获得CAPN3基因完整的CDS区及部分3′UTR序列,预测分析该基因编码蛋白的生物学信息.结果表明:牦牛CAPN3基因CDS区全长2 469bp(GenBank登入号:JX112349.1),编码822个氨基酸残基(GenBank登入号:AFP73395.1);同普通牛比对,牦牛CAPN3基因在CDS区存在10个SNPs,并导致该蛋白功能区域内3个氨基酸突变;牦牛CAPN3基因编码蛋白分子量94.58ku,理论等电点(PI)5.70,其氨基酸序列中存在较强的亲水区域,二级结构为以α-螺旋和无规卷曲为主的混合型;牦牛CAPN3基因编码氨基酸序列与普通牛、绵羊、野猪等物种间同源性较高,系统进化情况与其亲缘关系远近一致.

一个2A型肢带型肌营养不良家系CAPN3基因的突变分析

目的对一个2A型肢带型肌营养不良(limb-girdle muscular dystrophy type 2A)家系进行CAPN3基因的致病突变分析。方法收集先证者及家系成员的外周血,提取DNA,应用全外显子测序技术对先证者进行致病基因检测,然后用Sanger测序技术对先证者家系成员进行突变位点的验证。结果全外显子测序发现先证者携带CAPN3基因c.1194-9A>G和c.1437C>T(p.ser479=)的复合杂合突变。Sanger测序验证先证者母亲为CAPN3基因c.1194-9A>G变异携带者。家系中其他患者均存在相同的复合杂合突变,其未发病的姐姐和女儿为CAPN3基因c.1437C>T(p.ser479=)变异携带者,先证者的女婿未检测到上述位点变异。结论CAPN3基因c.1194-9A>G和c.1437C>T(p.ser479=)的复合杂合突变为该家系的致病原因。

CAPN3基因杂合缺失合并半合子突变致肢带型肌营养不良2A型2例

肢带型肌营养不良(limb-girdle muscular dystrophy,LGMD)是一组由基因突变导致的以近端肌肉无力为主要表现的遗传性肌病。由钙蛋白酶3(calpain 3,CAPN3)基因变异引起的肢带型肌营养不良2A型(limb-girdle muscular dystrophy type 2A,LGMD2A)是最常见的类型,其有高度临床和遗传异质性,临床表现多样且轻重不一,临床上易误诊。本文报告一家系中一对LGMD2A孪生兄弟的临床特点和遗传学特征。两人均以四肢近端无力为主要表现,血清肌酸激酶、肌电图、肌肉影像学和肌肉活检支持肌营养不良诊断。基因测序显示兄弟两人有相同的基因变异,即CAPN3基因2-14外显子杂合缺失合并c.526G>A(p.Val176Met)错义突变。因为错义突变正好位于这段缺失区域,因此显示点突变显示为特殊的“半合”变异状态。结合临床表现和基因检测结果,最终诊断为LGMD2A。其中,CAPN3基因2-14外显子杂合缺失在人类基因突变数据库中未报道,扩大了CAPN3基因的变异数据库,为该病的临床诊断和基因检测提供更多参考依据。

CAPN3基因非经典剪接位点突变致肢带型肌营养不良2A型患者3例的临床、肌肉病理和遗传学特点分析

目的探讨CAPN3基因非经典剪接位点突变致肢带型肌营养不良2A(LGMD2A)患者的临床、肌肉病理和遗传学特点。方法选取2016年7月至2018年7月于山东大学齐鲁医院就诊的3例LGMD2A患者为研究对象。收集其家系的临床资料,对先证者进行全外显子组测序,利用Sanger测序对候选变异进行家系验证。从先证者肌肉组织中提取RNA,利用逆转录聚合酶链反应验证剪接突变对先证者CAPN3基因前体mRNA剪接的影响。从先证者肌肉组织中提取蛋白,用蛋白质印迹法检测calpain 3蛋白的含量。结果3例先证者均存在四肢肌无力症状,近端重于远端。肌肉活组织检查结果均提示肌源性损害。基因检测表明先证者1携带CAPN3基因c.2185-14T>G和c.2305C>T(p.R769W)复合杂合突变,先证者2携带CAPN3基因c.1193+30G>A和c.20692070delAC(p.H690Rfs*9)复合杂合突变,先证者3携带CAPN3基因c.1194-9A>G纯合突变。剪接实验表明c.2185-14T>G突变位于内含子20,导致内含子20整体保留,c.1193+30G>A位于内含子9,导致内含子9前31个碱基保留,c.1194-9A>G突变位于内含子9,导致内含子9最后8个碱基保留。蛋白质印迹法结果表明先证者1和先证者2存在calpain 3蛋白缺失。结论LGMD2A患者以四肢近端肌力下降为主要临床症状,肌肉病理多表现为肌源性损害,非经典剪切位点突变致前体mRNA剪接异常在该病中发挥了致病作用。

牛CAPN3基因多态性及与肉质性状相关性分析

以中国草原红牛、西门塔尔牛、利木赞牛、天一冈山黑牛为试验对象,利用PCR-SSCP结合测序的方法进行SNPs检测,并采用SPSS软件分析CAPN3基因的遗传多态性与肉质性状的关系。结果表明,仅在草原红牛及天一冈山黑牛中发现第46 414处(NC_007308)发生G→T的突变,且发生G→T突变的位点所对应不同基因型的个体,其大理石花纹、失水率、滴水损失和剪切力这些肉质性状存在显著差异,而西门塔尔牛和利木赞牛中未发现此突变。

一个中国肢带型肌营养不良2A型家系的临床和分子遗传学研究

目的 分析一个肢带型肌营养不良（LGMD）家系的临床特点、肌肉病理特点和致病基因突变,总结表型/基因型关系.方法 收集并分析先证者（女）及其患病胞弟的临床和病理资料,提取2人与父母的外周血DNA.筛选61个与肌肉病相关的致病基因,设计肌病相关基因下一代测序靶向捕获试剂盒Sureselect,采用外显子靶向捕获结合下一代测序技术对先证者进行LGMD相关基因突变检测,发现CAPN3基因变异并经San-ger测序证实后对其弟及父母相同位点进行测序确定变异来源,查单核苷酸多态性数据库（dbSNP138）和基因突变数据库（http：//www.dmd.nl/）,确定致病突变.结果 本研究先证者为儿童期隐匿起病盆带肌为主的肌无力,逐渐表现为蹲下站起、上楼困难,无翼状肩和肥肠肌肥大,伴有跟腱挛缩和血清肌酸激酶（CK）升高（1 908～9 241 IU/L）,弟弟表现为“高CK血症”.利用外显子靶向捕获结合下一代测序技术对此临床诊断为LGMD患者进行基因筛查,发现姐弟均携带CAPN3基因的一个位点c.717delT及另一个位点c.2243G＞A的突变,并经一代测序验证,二者均为已报道致病突变.结论 LGMD临床和遗传异质性明显,外显子靶向捕获结合下一代测序技术能快速发现LGMD的致病基因突变,以利进一步准确进行基因型/表型分析。

Calpain蛋白病的临床表型和基因型分析(附一家系报道)

目的:分析比较一对疑为calpain蛋白病变中国姐弟的capn3基因型和临床表型。方法:对其姐进行肌肉活检作病理学检查和calpain-3/dysferlin联合免疫印迹检测。根据文献设计引物,采集该17岁的姐姐和13岁的弟弟外周血进行capn3基因全部24个外显子直接测序,同时行MRI以观察肌肉组织受累情况。结果:本研究为首次对国内肢带型肌营养不良症2A(LGMD 2A)患者进行基因筛查。姐姐表现为典型LGMD症状,伴有翼状肩及跟腱挛缩,MRI亦提示大腿后群肌肉受累;免疫印迹检测结果提示为calpian蛋白病患者。直接测序发现姐弟均携带capn3基因的一个位点错义突变c.146G>A及另一个位点c.329G>A。本研究还对c.329G>A位点在110名正常人血标本进行单核苷酸多态性分析,仅1例携带杂合突变,预测软件提示此位点改变无显著意义。弟弟携带同样的基因突变,但表现为无症状的高磷酸肌酸激酶(CK)血症。结论:calpain蛋白病患者中,相同的基因型可以出现不同的临床表型,不仅可表现为LGMD2A,而且还可以表现为无症状高CK血症。

关节挛缩伴强直脊柱综合征1例报道并文献复习

目的报道1例以关节挛缩伴强直脊柱综合征为主要表现的肢带型肌营养不良2A(LGMD2A)病例,提高对以关节挛缩及强直脊柱综合征为主要表型的肌肉疾病的认识。方法收集1例以关节挛缩伴强直脊柱综合征为表征最终确诊为LGMD2A患者的临床资料、肌肉活检(病理染色、Western blot)、基因检测和肌肉影像学等资料,结合文献复习进行分析。结果患者除早期出现的全身关节挛缩伴强直脊柱外,合并有四肢近端肌肉萎缩、无力,明显翼状肩。家族史提示常染色体隐性或X连锁隐性遗传可能;肌肉MRI示大腿后群、内侧群,小腿后群显著受累;肌肉病理检查示肌营养不良表现;Western blot检测示calpain-3条带完全缺失,CAPN3基因检测示患者携带c.534A>G(I178M)及c.411dupC(C137fs)双杂合突变,并均为新发突变。最终诊断为LGMD2A。结论临床中对于早发关节挛缩伴强直脊柱综合征的患者,需考虑LGMD2A可能,肌肉MRI可为LGMD2A的诊断和鉴别诊断提供重要线索。