外源脱水应答转录因子CBF4基因转化玉米的获得

用PCR方法克隆了拟南芥脱水应答转录因子CBF4基因,以逆境诱导表达基因rd29A的启动子为驱动,构建了逆境诱导表达载体pBAC146。用基因枪转化法转化玉米优良自交系的幼胚和胚性愈伤组织,轰击后的愈伤组织经过筛选、分化和植株再生过程,共获得36棵转基因植株。经PCR、PCR-Southern和Southern检测表明,外源目的基因已成功整合到部分转基因玉米株系的基因组中。人工干旱处理下,抗旱生理指标测定显示,一个转基因株系的脯氨酸含量和叶绿素含量比野生型对照提高一倍,间接表明转基因株系的抗旱能力在某种程度上有所提高。

转录因子CBF4诱导型启动子的克隆及功能分析

根据已有文献及公开的拟南芥基因组序列,利用PCR方法从拟南芥(Arabidopsisthaliana)基因组DNA中扩增得到了转录因子CBF4上游的DNA片断,对其进行序列分析表明与GenBank序列高度同源,同时对其进行初步的功能分析。采用生物信息学方法对这一序列分析的结果显示这一片段具有启动子的特殊结构域;与GUS基因融合构建双元表达载体,转化烟草的组织特异性表达检测可见明显的GUS活性,初步表明所获片断为CBF4基因的诱导型启动子。

共转化CBF4和bar基因蒙农杂种冰草植株的分子检测

在获得转CBF4和bar基因蒙农杂种冰草植株的基础上,应用PCR和Sou thern杂交技术检测外源基因在转基因蒙农杂种冰草植株中的整合及拷贝数.确定外源基因CBF4和bar基因已经整合到冰草基因组中,并且是以多拷贝的整合方式插入受体细胞的染色体上.说明外源基因对蒙农杂种冰草成功地进行了转化,可以作为后期转基因冰草植株研究及培育转基因冰草新品种的材料.

基因枪法获得转CBF4基因蒙农杂种冰草的研究

为快速培育出优良的冰草品种,以蒙农杂种冰草(Agropyron cristatum×A.desertorumcv.Mengnong)幼穗为材料,以拟南芥外源脱水应答转录因子CBF4基因为目的基因,利用基因枪轰击蒙农杂种冰草幼穗诱导愈伤组织,经筛选后获得了抗性转化植株,进一步经PCR和RT-PCR检测得到了670bp左右的电泳条带,表明CBF4基因已在蒙农杂种冰草中得到表达。

两种启动子调控下的CBF4基因植物表达载体的构建

目的:构建由组成型启动子CaMV35s和诱导型启动子CBF4P调控的转录因子CBF4基因的两个植物表达载体。方法:用EcoRⅠ酶将CBF4和CBF4P两个基因切下,连接到BluescriptM13(SK)上,分别构建成两个中间载体SK-CBF4和SK-CBF4P,再利用SK上的多克隆位点与植物表达载体p3301上相同的酶切位点,将CBF4和CBF4P连接到植物表达载体p3301上,分别构建了由组成型启动子CaMV35s和诱导型启动子CBF4P调控的转录因子CBF4基因的两个植物表达载体p3301-CBF4和p3301-CBF4P。结果:用PCR扩增重组质粒p3301-CBF4和p3301-CBF4P,分别得到了670bp和1200bp的特异性片段。酶切检测也分别得到了与预期结果一致的DNA片段。结论:所构建的两个表达载体均正确,可用于植物遗传改良和两种启动子的启动效率的研究。

CBF4基因植物表达双元载体的构建

目的:对拟南芥CBF4基因序列进行克隆。方法:用限制性内切酶将CBF4基因从pMD18-T CBF4载体上切下,定向连接到含超强启动子的pC2301-35S-OCS表达载体上,成功构建了CBF4基因植物表达载体pC2301-35S-OCS-CBF4。利用冻融法将此表达载体导入只含辅助质粒的根癌农杆菌中,提取转化质粒,经PCR扩增和酶切验证鉴定表明。结果:CBF4基因植物表达双元载体构建成功。结论:转CBF4基因烟草的抗寒性比野生型烟草要高。

拟南芥CBF4基因启动子缺失载体的构建及转化

利用PCR方法,从拟南芥基因组中克隆脱水响应因子CBF4基因启动子全序列4A(1 260 bp)及两段不同长度5′缺失片段4B(565 bp)和4C(470 bp),通过亚克隆构建含有该系列启动子的可溶性绿色荧光蛋白基因(smGFP)的植物表达载体p1301-4A-GFP、p1301-4B-GFP、p1301-4C-GFP,用农杆菌介导烟草叶盘法分别导入烟草。20%PEG6000模拟干旱诱导转基因植株,检测转基因烟草转入不同启动子片段烟草植株诱导前后叶片GFP的表达强度。在倒置荧光显微镜和384 nm紫外灯照射下检测到的全片段4A与5′缺失片段4B和4C转化植株均显荧光,且随启动子长度的变短,荧光强度逐渐增强。基本确定了启动子的核心区域为4C(470 bp)。

葡萄CBF4基因生物信息学及其对低温和硅酸钾响应分析

为探究葡萄CBF4基因的结构和表达特征,该研究以葡萄为材料,对葡萄CBF4基因进行生物信息学及低温和硅酸钾响应分析。结果表明:(1)CBF4蛋白定位在细胞核,有5个磷酸化位点和14个糖基化位点,无信号肽,是一个亲水的、脂溶性较差的膜外蛋白。二级结构以无规则卷曲为主,比例为56.88%。该蛋白包含一个AP2/EREBP结构域。(2)CBF4蛋白的多序列和系统进化分析表明酿酒葡萄与美洲葡萄的同源性最高、亲缘关系最近。(3)荧光定量PCR分析显示,低温胁迫后CBF4基因在葡萄叶片中表达水平上调,说明CBF4基因可能参与了葡萄叶片低温胁迫的响应。低温条件下,施加硅酸钾CBF4基因表达具有差异性,说明该基因在不同的葡萄组织中对硅酸钾的响应机制可能不同。以上结果为进一步研究葡萄CBF4基因的功能和机理奠定了基础。

冰草组织培养再生体系建立及耐旱转基因研究

本研究以冰草属植物中的4个品种——蒙古冰草新品系(A.mongolicumKeng)、航道冰草(A.cristatumcv.Fairway)、诺丹冰草(A.desertorumcv.Nordan)和一个种间杂种冰草——蒙农杂种冰草(A.cristatum×A.desertorumcv.Hycrest-Mengnong)为材料,分别以幼穗为外植体建立了冰草组织培养再生体系。在此基础上,以调控脯氨酸生物合成最后一步的关键酶的突变体基因P5CS为目标基因,bar基因为筛选标记基因,用基因枪法轰击幼穗诱导的愈伤组织,获得转基因植株。利用PCR方法从拟南芥(Arabidopsisthaliana)基因组DNA中分离得到了CBF4及其启动子,并对CBF4启动子进行了序列分析和初步的功能分析。结果表明:1.冰草幼穗的取样时期为孕穗期,长度介于1.0～3.0cm的幼穗为最适宜的外植体;诱导愈伤组织的最适培养基为改良MS+2,4-D2.0mg/L,诱导率83.5%;分化培养基为MS+KT0.2mg/L,分化率74.5%;生根培养基为1/2MS,生根率100%。2.以幼穗诱导的愈伤组织为受体,采用基因枪轰击法转化冰草获得转基因植株;PCR和Southern检测表明外源基因P5CS已整合到冰草属植物基因组DNA中;RT-PCR检测表明目的基因已在冰草转基因植株的转录水平表达;P5CS基因的遗传转化率为0.09%～0.11%。3.采用PCR方法从拟南芥中分离了CBF4基因及其启动子序列。