酸性纤维素酶CBHⅡ基因与非抗性穿梭表达载体的重组及在乳酸杆菌的表达及其活性检测

以SmaI和SphI双酶切pMD18-T-CBHⅡ和以胸苷酸合成酶基因(thymidylate synthase,thyA)为选择压力的非抗生素抗性的穿梭表达载体pW425t,胶回收酸性纤维素酶CBHⅡ基因和载体大片段,并将纯化的CBHⅡ基因和表达载体pW425t大片段进行连接,构建出可以在乳酸菌与大肠杆菌之间穿梭表达的原核表达重组质粒pW425t-CBHⅡ。将pW425t-CBHⅡ转化至thyA基因缺陷型的乳酸杆菌感受态细胞中,通过质粒提取、酶切鉴定、PCR鉴定、测序分析和生长功能弥补筛选阳性克隆。SDS-PAGE分析,可见约49.6 ku的蛋白,并且刚果红染色显示重组乳酸杆菌可产生明显的水解圈。

绿木霉ZY-01的外切葡聚糖酶CBHⅠ基因的克隆及在E.coli中的表达

以前期分离筛选得到的高产纤维素酶菌株TrichodermavirensZY-01的总RNA为模板合成cDNA,经PCR克隆得到外切葡聚糖酶(cellobiohydrolase,CBH)Ⅰ基因;并构建了pET-32a-cbh1表达载体,通过转化至E.coli BL21(DE3)中,获得CBHⅠ重组表达系统,成功表达出可溶性CBHⅠ蛋白。结果表明,Trichoderma virens ZY-01CBHⅠ碱基序列与Trichoderma viride AS 3.3711CBHⅠ基因(GenBank:AY368686.1)序列相似度高达91.95%,氨基酸同源性高达99.22%;通过SDS-PAGE检测,表明该基因在E.coli中得到可溶性表达,分子量约为53kDa,与基因翻译出的氨基酸序列相一致。该研究为CBHⅠ基因的工程化及应用提供了基础。

康宁木霉AS3.2774纤维素酶CBHⅡ基因与乳酸菌非抗性穿梭表达载体的重组及在大肠杆菌中的表达

以康宁木霉AS3.2774 m RNA为模板,通过RT-PCR技术,扩增了1 413 bp的CBHⅡ全长基因,利用T-A克隆,将CBHⅡ克隆至克隆载体p MD18-T Simple Vector,构建质粒p MD18-T-CBHⅡ。以Sma I和Sph I双酶切p MD18-T-CBHⅡ和以胸苷酸合成酶基因(thymidylate synthase,thy A)为选择压力的非抗生素抗性的穿梭表达载体p W425t,将纯化的CBHⅡ亚克隆到p W425t中,得到原核表达重组质粒p W425t-CBHⅡ,可在乳酸菌与大肠杆菌之间穿梭表达。将p W425t-CBHⅡ转化在thy A基因缺陷型的大肠杆菌感受态E.coli X13中,通过质粒提取、PCR鉴定、酶切鉴定、分析测序以及生长功能弥补筛选阳性克隆。SDS-PAGE分析,约49.6 k D的蛋白可见,刚果红染色显示重组大肠杆菌可产生明显的水解圈,并用p NPC法测得重组大肠杆菌的CBHⅡ酶活力在温度50℃、p H值5.0时达到最大。

长期保护性耕作对纤维素降解基因cbh Ⅰ多样性的影响

研究了免耕秸秆覆盖（CntWntS）、耕作秸秆覆盖（CntWtS）、免耕秸秆不覆盖（CntWnt）和耕作秸秆不覆盖（CntWt）四种保护性耕作措施对黄淮海平原典型潮土中纤维素降解菌多样性的影响。采用PCRRFLP技术分别对纤维素降解菌cbh I基因进行多样性分析。结果表明,CntWntS与CntWnt相比,纤维素降解菌的数量增加了148%,而CntWtS与CntWt相比,纤维素降解菌的数量也增加了130%。纤维素降解菌cbh I基因分型在四个处理小区比较丰富,共有44个OTUs,其中CntWntS、CntWtS、CntWnt、CntWt处理中分别有35、34、30、30个OTUs。多样性指数分析显示,Shannon-Wiener指数的数值范围为3.09~3.36。系统发育分析表明,文库中的纤维素降解菌分别属于Basidiomycota（担子菌门）和Ascomycota（子囊菌门）,同时发现土壤中存在大量的未培养纤维素降解菌。因此,免耕和秸秆覆盖等保护性耕作能够明显提高土壤中纤维素降解菌数量和cbh I基因多样性。

高产纤维素酶绿色木霉基因工程菌的构建

[目的]构建CBHⅡ基因过量表达的绿色木霉工程菌。[方法]根据绿色木霉cDNA序列设计合成引物,PCR扩增CBHⅡ基因序列,将完整的目的基因与表达载体pCAMBIA1302连接,转入大肠杆菌DH5α中,获得重组质粒pCAMBIA1302-CBHⅠ。再将pCAM-BIA1302-CBHⅠ重组质粒与瑞氏木霉外切葡聚糖纤维二糖水解酶Ⅱ(CBHⅡ)PcbhⅡ启动子片段连接,将潮霉素磷酸转移酶(hyg)基因片段插入PcbhⅡ启动子下游,转入大肠杆菌DH5α中,获得重组表达质粒pCAMBIA1302-CBHⅡ。[结果]构建的重组表达质粒电转化后经SDS-PAGE电泳检测,绿色木霉纤维素酶CBHII基因在原宿主菌中成功过量表达,证实CBHⅡ基因在PcbhⅡ启动子控制下进行高效表达。[结论]为高产纤维素酶系的工业化菌株构建奠定基础。

血管紧张素Ⅰ转换酶基因与急性脑血管病的相关性研究

采用ＰＣＲ扩增方法鉴定１３７例急性脑血管病（脑出血７１例，脑血栓形成５２例，蛛网膜下腔出血１４例）病人和１８６例正常对照的血管紧张素Ⅰ转换酶（ＡＣＥ）基因多态性，以观察急性脑血管病的发病与ＡＣＥ基因多态性之间的关系。结果发现：脑出血病人ＡＣＥ插入／插入（ⅠⅠ）纯合型频率明显高于对照组（０．５０７ＶＳ０．３６），而缺失／缺失（ＤＤ）纯合型频率则明显低于对照组（０．０７ＶＳ０．１７２）（Ｐ＝０．０３５４）；脑血栓形成和蛛网膜下腔出血病人ＡＣＥ基因多态频率与对照组差别不大（Ｐ＞０．０５）。提示ＡＣＥ基因ⅠⅠ纯合型可能为脑出血患者发病的易感因子。

里氏木霉纤维二糖水解酶Ⅱ的生物信息学研究

利用生物信息学方法对里氏木霉CBHⅡ蛋白结构进行了分析,初步明确了其主要功能区的位置及结构特征.通过对比分析cbh1和cbh2基因上游表达调控区序列特征,分析了cbh2基因表达活力弱的原因可能是由于激活因子作用位点少、其分布位置不当导致,据此提出了增强cbh2基因表达强度的方案.

丝状真菌瑞氏木霉外源基因表达系统的构建

采用PCR技术体外扩增获得了瑞氏木霉外切葡聚糖纤维二糖水解酶Ⅰ (CBHⅠ )启动子和终止子序列 .并以大肠杆菌质粒pUC1 9为骨架 ,在该启动子和终止子序列间加入多克隆位点 ,构建了瑞氏木霉强表达整合型载体pTRIL .以质粒pAN7 1为模板 ,体外扩增了带有潮霉素磷酸转移酶(hph)基因的DNA片段 ,将hph插入pTRIL的cbh1启动子和终止子序列之间 ,构建了Pcbh1 hph Tcbh1表达盒 .用此表达盒转化瑞氏木霉C30原生质体 ,在潮霉素平板上得到 1 5株抗性转化子 .对其中的H1转化子进行了PCR和Southern印迹分析 ,证实hph基因确实整合到转化子染色体DNA上 ,并在Pcbh1 启动子控制下进行高效表达 .转化子H1对潮霉素抗性达 1 5 0mg L ,比出发菌株提高 2倍 .

绿色木霉外源基因表达系统的构建

利用PCR方法克隆瑞氏木霉(Trichoderma reesei)外切葡聚糖纤维二糖水解酶Ⅰ基因(cbhⅠ)启动子序列,以pSK载体为骨架,构建了pSK-cbhⅠ-GFP-hph表达载体,并成功转入到绿色木霉(T.viride)Sn-9106中。通过对绿色木霉Sn-9106进行遗传改造,为纤维素酶基因在木霉中同源重组表达提供遗传转化平台。