酸性纤维素酶CBHⅡ基因与非抗性穿梭表达载体的重组及在乳酸杆菌的表达及其活性检测

以SmaI和SphI双酶切pMD18-T-CBHⅡ和以胸苷酸合成酶基因(thymidylate synthase,thyA)为选择压力的非抗生素抗性的穿梭表达载体pW425t,胶回收酸性纤维素酶CBHⅡ基因和载体大片段,并将纯化的CBHⅡ基因和表达载体pW425t大片段进行连接,构建出可以在乳酸菌与大肠杆菌之间穿梭表达的原核表达重组质粒pW425t-CBHⅡ。将pW425t-CBHⅡ转化至thyA基因缺陷型的乳酸杆菌感受态细胞中,通过质粒提取、酶切鉴定、PCR鉴定、测序分析和生长功能弥补筛选阳性克隆。SDS-PAGE分析,可见约49.6 ku的蛋白,并且刚果红染色显示重组乳酸杆菌可产生明显的水解圈。

绿色木霉纤维二糖水解酶基因cbhⅡ的克隆及其在粟酒裂殖酵母中的表达

采用粟酒裂殖酵母诱导表达系统进行绿色木霉纤维二糖水解酶基因cbhⅡ的表达研究。通过PCR方法从绿色木霉基因组DNA中克隆到长度为1611bp并含有信号肽序列的cbhⅡ基因;将其插入到粟酒裂殖酵母诱导型表达载体pESP-2的Pnmt1启动子下游,得到重组质粒pESP-2-cbhⅡ;利用电转化方法将其转入粟酒裂殖酵母SP-Q01细胞中,通过对酵母转化子质粒DNA的PCR和双酶切鉴定,得到了含有cbhⅡ基因的酵母转化子,对转化子进行诱导培养后提取酵母总蛋白,进行SDS-PAGE电泳检测,得到一条约为81kD的目的蛋白条带;利用DNS法对酵母转化子上清液中的纤维二糖水解酶活性进行测定,结果表明,酶活力最大值为165U/mL。以上结果证明:cbhⅡ基因在Pnmt1启动子控制下在粟酒裂殖酵母中成功地获得表达,并且cbhⅡ自身的信号肽可以被粟酒裂殖酵母正确的识别,并将表达产物分泌至胞外。

纤维素酶基因(BGLⅠ、CBHⅡ)与DREB1A基因双价植物表达载体的构建

本研究以pAHC17、pCD29A质粒为基础,分别构建了玉米泛蛋白(Ubi)启动子调控的纤维素酶基因(BGLⅠ、CBHⅡ)与rd29A启动子调控的DREB1A基因的双价植物表达载体pBDB,pBDC。其植物选择标记基因为乙酰CoA转移酶基因(BAR),该载体适用于单子叶植物的遗传转化。并通过冻融法将重组质粒导入根癌农杆菌LBA4404中,为利用农杆菌介导法进行BGLⅠ,CBHⅡ和DREB1A基因对单子叶植物的基因工程研究奠定了基础。

绿色木霉纤维二糖水解酶Ⅱ的X射线辐射损伤研究

南京师范大学生命科学学院,江苏南京210097摘要根据半胱氨酸相关的拉曼光谱分析指标,采用X光管1.82keV,40mA,处理4h的辐射条件,水溶液中绿色木霉纤维二糖水解酶Ⅱ的各种S—H伸缩振动拉曼谱带虽然偏移不多,但呈现了二极分化的演变状态。辐照后的样品中2554cm-1峰宽加大。辐照没有引起维系高级空间结构存在的二硫键断裂,二硫键键长有缩小变化,二硫键几何构象类型未改变,但各种异构体成分的相对含量有变化,辐射前半胱氨酸C—S键异构体特征模PC型略多,辐射后PN和PH型增多。除半胱氨酸CH2摇摆的贡献在辐射后有明显减弱外,此辐射条件没有造成拉曼技术所能证明的与巯基有关的蛋白结构的明显损伤,但可见有变化存在。

绿色木霉纤维素酶分子侧链构象与侧链环境特征的研究

运用拉曼光谱分析技术能够揭示蛋白质分子基团振动特征 ,本文对绿色木霉 (Trichodermaviride)纤维素酶中的CBHⅡ在固态以及两种 pH值的液态中酶分子的侧链构象与侧链环境状态进行了拉曼分析。结果揭示了CBHⅡ中胱氨酸的CαCβ—S—S′—Cβ′Cα′基团和C—S键 ,蛋氨酸 (甲硫氨酸 )的CαCβ—Cγ—SC基团 ,HCβ—CγS基团和C—S键 ,以及半胱氨酸的HCβ—CγS基团和C—S键的构象特征。实验还证明14个色氨酸是部分暴露的 ,C2—C3—Cβ—Cα 侧链的扭转角[χ2.1]形式多样。在 pH6.0和固体样品中 ,酶蛋白中酪氨酸均为强氢键供体 ,两种样品各有20.3 %、25.1 %是暴露于溶剂的。而pH8.0水溶液中酪氨酸酚羟基成键能力特点是既可做氢键供体 ,又可做氢键受体 ,它们有80

高产纤维素酶绿色木霉基因工程菌的构建

[目的]构建CBHⅡ基因过量表达的绿色木霉工程菌。[方法]根据绿色木霉cDNA序列设计合成引物,PCR扩增CBHⅡ基因序列,将完整的目的基因与表达载体pCAMBIA1302连接,转入大肠杆菌DH5α中,获得重组质粒pCAMBIA1302-CBHⅠ。再将pCAM-BIA1302-CBHⅠ重组质粒与瑞氏木霉外切葡聚糖纤维二糖水解酶Ⅱ(CBHⅡ)PcbhⅡ启动子片段连接,将潮霉素磷酸转移酶(hyg)基因片段插入PcbhⅡ启动子下游,转入大肠杆菌DH5α中,获得重组表达质粒pCAMBIA1302-CBHⅡ。[结果]构建的重组表达质粒电转化后经SDS-PAGE电泳检测,绿色木霉纤维素酶CBHII基因在原宿主菌中成功过量表达,证实CBHⅡ基因在PcbhⅡ启动子控制下进行高效表达。[结论]为高产纤维素酶系的工业化菌株构建奠定基础。

绿色木霉纤维二糖水解酶基因的克隆及其在乳酸菌中的表达与鉴定

采用乳酸菌表达系统进行绿色木霉纤维二糖水解酶基因cbhⅡ的表达研究。参照Gen Bank上发表的绿色木霉(Trichoderma viride)cbhⅡ基因(Gen Bank登录号:M55080)设计引物并通过聚合酶链式反应克隆获得其c DNA序列长1 441 bp。为了达到表达分泌该酶的目的,在其基因上游序列前添加了大小为80 bp的信号肽序列。进一步通过生物信息学方法将密码子按照乳酸菌的偏好性进行了优化,通过全基因合成获得了优化后的cbhⅡ基因。将该基因与穿梭表达载体p MG36e连接,构建原核表达载体p MG36e-S-cbhⅡ;利用电转化方法将其转入乳酸乳球菌NZ3900感受态细胞中构建重组乳酸菌,纯化的重组菌蛋白通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳检测,得到一条约为53 k D的目的蛋白条带,与预期大小相符;利用3,5-二硝基水杨酸法测定培养基上清液中水解纤维素酶的活力达到16.7 U/m L,菌体裂解液上清液和菌体沉淀几乎没有酶活力。结果表明,纤维二糖水解酶基因信号肽序列被乳酸乳球菌正确识别,并成功实现了胞外表达。

绿色木霉纤维素酶分子内氢键特征的研究

运用能够揭示蛋白质分子基团振动特征的激光拉曼光谱分析技术,对绿色木霉纤维素酶中的CBHⅡ在固态以及两种pH值的液态中酶分子内的氢键状态进行了分析。结果表明相对于纤维素酶固体干粉,液态中酶分子酰胺Ⅰ羰基氧原子作为氢键质子受体的能力为上升;酰胺Ⅱ与酰胺Ⅰ的β结构特征峰变化倾向相似。在3种样品中,酶蛋白中Trp均为强氢键供体,从成键能力方面证实了以往同类酶空间分析的结果。固体与pH 6 0水溶液酶蛋白中酪氨酸酚羟基成键能力也是强的。根据游离巯基分析可以判断绿色木霉CBHⅡ的成熟肽CBD与瑞氏木霉CBHⅡ的CBD有相似的二硫键构成。