靶向人c-Cbl基因重组干扰慢病毒与过表达腺病毒载体的构建、鉴定以及病毒功效研究

目的:构建可调控c-Cbl基因表达的重组慢病毒与腺病毒并评估其功效。方法:应用基因重组技术,分别构建靶向人c-Cbl基因的干扰慢病毒和过表达腺病毒。采用定量PCR和免疫印迹法检测病毒感染后白血病细胞(HL60、THP1)c-Cbl基因表达与转录本的变化。结果:3个靶向人c-Cbl基因的重组干扰慢病毒载体经测序验证构建成功,包装的病毒滴度均大于1×10^(8)TU/ml,其中shRNA-2号慢病毒干扰效率最高,白血病细胞感染后c-Cbl基因的表达约下调95%,CBL蛋白的表达约下调60%;同时,靶向人c-Cbl基因的重组过表达腺病毒载体也经测序验证构建成功,包装的病毒滴度大于1×10^(9)TU/ml,细胞感染腺病毒后,c-Cbl基因表达可瞬时上调约10倍,CBL蛋白表达约上调1.5倍。结论:重组干扰慢病毒和过表达腺病毒均可高效感染白血病细胞,并能分别下调和上调c-Cbl基因与CBL蛋白的表达,为后续研究肿瘤细胞内c-Cbl基因功能打下前期基础。

类钙调磷酸酶B亚基蛋白GhCBL3-A01调控棉花黄萎病抗性的功能分析

【目的】解析类钙调磷酸酶B亚基蛋白(calcium B-like protein,CBL)基因GhCBL3-A01在棉花抗黄萎病反应中的功能,为棉花抗病育种提供基因资源。【方法】从棉花基因组数据库获得GhCBL3-A01基因的同源序列,进行生物信息学分析。采用实时荧光定量聚合酶链式反应(quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR)检测大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)、茉莉酸甲酯(methyl jasminate,MeJA)和H2O2处理的棉株中GhCBL3-A01基因的表达量变化。利用病毒诱导的基因沉默(virus-induced gene silencing,VIGS)技术研究GhCBL3-A01在棉花抗黄萎病中的功能。通过检测活性氧积累以及相关基因的表达量,初步分析GhCBL3-A01的作用机制。【结果】陆地棉中GhCBL3-A01及其3个同源蛋白均含有3个CBL家族典型的EF-hand结构域。大丽轮枝菌、MeJA和H2O2处理后,GhCBL3-A01的表达量显著升高。VIGS沉默GhCBL3-A01导致病株率和病情指数显著降低,茎秆维管束褐变程度减轻,有病菌繁殖的茎段数量明显减少,增强了棉株对黄萎病的抗性。GhCBL3-A01基因沉默棉株叶片中活性氧积累增多,防御相关基因PR1、NPR1、PR4和PDF1.2以及茉莉酸信号通路关键基因AOS1、OPR3、MYC2和LOX2的表达量增加。【结论】GhCBL3-A01通过调控防御相关基因、茉莉酸信号通路基因的表达和活性氧积累负调控棉花对黄萎病的抗性,是提高棉花黄萎病抗性的候选基因。

小麦CBL基因家族鉴定及表达模式分析

类钙调磷酸酶(CBL)蛋白是植物中独特的Ca 2+传感蛋白,对植物应对非生物胁迫具有重要作用。为探究小麦CBL基因的功能,利用生物信息学方法从小麦全基因组数据库中共鉴定出68个小麦CBL基因家族成员,并对其进行了理化性质、基因结构、进化树和共线性分析。结果表明,小麦CBL蛋白为酸性亲水性蛋白质,其对应基因分布于18条染色体上,亚细胞定位分布广泛,核中最多;蛋白结构域高度保守,都含有EF-hand结构域,且同一类群中的大多数成员具有相似的motif。与水稻进行种间共线性分析发现,二者的CBL基因之间存在较多的共线性关系。以强抗寒冬小麦品种东农冬麦1号和东农冬麦2号为材料,对转录组分析显示出的8个在低温下表达差异显著的CBL进行qRT-PCR分析发现,这8个基因在不同小麦品种和不同组织部位都存在明显的差异表达,分蘖节中CBL的表达量在-25℃时达到峰值,而叶片中CBL的表达量在-10℃时达到峰值,说明CBL基因在低温胁迫调节中起重要作用。

梨CBL基因家族全基因组序列的鉴定及非生物胁迫下的表达分析

【目的】最近在植物中发现了一类Ca2+传感蛋白——类钙调磷酸酶B亚基蛋白CBL(calcineurin B-likeproteins),CBL及其靶蛋白CIPK(CBL-interacting protein kinase)构成CBL/CIPK信号网络系统,在植物干旱、盐渍、低温等逆境胁迫应答中起重要作用。鉴定梨基因组中CBL家族基因成员,对其基因进化、结构与表达特征进行分析,为植物CBL基因功能分析与利用提供依据。【方法】通过生物信息学手段,结合梨基因组注释信息,鉴定梨CBL家族成员序列信息;利用MEGA6.0程序进行多序列比对、分类并构建系统进化树;利用per1程序、GSDS工具以及ClustalX软件进行基因结构与保守性分析;通过qRT-PCR技术进行多种非生物胁迫处理下PbCBLs表达分析。【结果】成功鉴定出7个CBL家族成员,基因结构预测表明PbCBL9含5个内含子,其余PbCBLs均含有7—8个内含子;预测的PbCBLs均含4个EF-hand功能域,且相邻EF-hand功能域之间氨基酸数目非常保守;通过系统发育树分析,将7个PbCBLs分为2类;qRT-PCR技术进行不同胁迫处理下杜梨叶片PbCBLs的表达分析,结果表明,在NaCl胁迫下,PbCBL1表达量6h降至最低,24h则明显升高;与之相反,PbCBL2和PbCBL3的表达量在6h达最高,24h最低;PbCBL4和PbCBL8表达量在3h明显增加,随后表达量下降;PbCBL9表现明显的上调趋势,24h达到最大;PbCBL10则在6h表达量最高。10%(w/v)PEG6000胁迫处理下,PbCBL2、PbCBL4和PbCBL8表达量上调,PbCBL1表达量下调;PbCBL3、PbCBL9和PbCBL10表达量均在6h最低,12h和24h较6h明显升高,PbCBL3和PbCBL10于24h表达量达到最高,而PbCBL9在12h表达量最高。4℃低温处理下,PbCBL2、PbCBL4、PbCBL8表达量上调;而PbCBL1和PbCBL3表达量下调;PbCBL9和PbCBL10表达量表现上下波动的变化趋势,均在3h有明显增加,随后显著降低。42℃高温胁迫处理下,PbCBL1、PbCBL3和PbCBL4表达量下调;PbCBL2表达量整体上调,6h达到最高;PbCBL8、PbCBL9和PbCBL10总体呈现相同的变化趋势,在3h表达量达到最高,随后明显下降。ABA处理下,PbCBL3和PbCBL10表达量下调,PbCBL2与PbCBL8表达量上调;PbCBL1在6h表达量最高;PbCBL4和PbCBL9表达量呈现相似的变化趋势,3h明显升高,随后下降,24h时最低。【结论】成功鉴定的7个候选PbCBLs中,2个基因(PbCBL8和PbCBL9)受盐胁迫诱导表达,3个基因(PbCBL2、PbCBL4和PbCBL8)分别受干旱、低温与ABA诱导表达。PbCBL2在高温胁迫下被强烈诱导可能意味着其在高温应答中发挥重要作用。

农杆菌介导CBL基因对菊花品种‘C008’的转化

以菊花品种‘C008’无菌苗叶片作为外植体,在建立了菊花高效再生体系的基础上,通过农杆菌介导法将CBL基因导入菊花品种‘C008’中。试验共获得抗性植株41株,PCR检测表明,阳性植株为5株,证明CBL基因已转化到菊花‘C008’的基因组DNA中,转化率为12.2%。遗传转化过程中,预培养2d后,将OD_(600)=0.5~0.6的农杆菌稀释50倍后侵染叶片8min,再共培养2d、延迟筛选2d,有利于获得较高的转化率。

高粱CBL家族基因的鉴定和初步分析

植物CBL家族基因在逆境响应过程中具有重要功能。本文利用生物信息学的方法,从高粱的基因组中鉴定出8个CBL基因,并对这些基因的染色体分布、序列特征、遗传进化和蛋白基序进行了系统分析。结果表明,高粱的CBL基因分为3个不同的进化类群,它们在基因组中的分布是不均匀的。高粱CBL基因预测编码的蛋白大多含有3个EF-手型结构,而且它们被预测定位在不同的细胞组分中。这些结果说明高粱CBL存在结构上的分化,可能它们的功能有所不同,这为进一步研究高粱CBL基因的功能以及利用它们进行高粱的分子育种改良奠定了基础。

c-cbl反义RNA抑制K562细胞的增殖

为探讨原癌基因c-cbl对CML细胞增殖的影响,我们用RT-PCR克隆了包括5′端非编码区的人类c-cbl基因部分序列,将之反向插入pcDNA3载体,并转染K562及NB4细胞。经MTT实验、半固体集落培养和流式细胞术观察细胞增殖能力的改变。结果表明,限制性酶切分析及序列测定证明所克隆的基因核苷酸序列正确,MTT实验显示反义载体转染K562细胞生长明显受抑,24、48及72小时增殖抑制率分别为30.07％,42.53％和55.75％(P值均<0.001),FCM-BrdU法测定的细胞倍增时间之比为1∶1.87(P<0.02),细胞集落形成抑制率为33.01％,反义转染基因NB4细胞增殖率无改变。上述结果直接地证明了c-cbl在CML细胞生长中的重要性。

玉米ZmCBL5-2基因的克隆及其转化拟南芥

CBLs(calcineurin B-like proteins)是植物细胞中1个重要的Ca2+传感蛋白家族,它们广泛参与植物对高盐和干旱等非生物逆境的应答反应。在玉米基因组中存在至少9个CBL编码基因,其中ZmCBL5因为存在可变剪接而有编码框为657bp和444bp两种转录本,我们称之为ZmCBL5-1和ZmCBL5-2。本论文运用RT-PCR方法克隆了ZmCBL5-2的编码框cDNA,然后构建了其植物表达载体并转化了拟南芥,经PCR检测证明获得T1代转基因植株,为进一步研究其在抗逆性中的作用奠定了基础。

两个甘蓝CBL基因的基因组解析

利用比较基因组学的方法从甘蓝基因组中鉴定出两个CBL基因,并对其结构、遗传进化、顺式元件进行了分析,以期为进一步研究这两个基因的功能和利用它们进行甘蓝抗逆分子育种提供有益借鉴。

Cbl-b基因介导T细胞免疫杀伤小鼠LA795肺腺癌细胞的实验研究

目的利用特异性小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)沉默T细胞Cbl-b基因表达,观察转染T细胞对小鼠肺腺癌细胞LA795的体外免疫杀伤作用。方法筛选高效特异性沉默Cbl-b基因的siRNA序列转染T739小鼠脾脏T细胞,转染72h后,利用酶联免疫吸附法(ELISA)检测IL-2、INF-γ等T细胞免疫因子分泌情况,比较单纯T细胞、阴性对照T细胞及转染T细胞与小鼠肺腺癌细胞LA795混合培养肿瘤杀伤率。结果转染72h后,转染组细胞因子IL-2、INF-γ分泌水平较空转组和空白组显著增加。在体外实验中,与单纯T细胞及阴性对照T细胞相比,转染T细胞能更高效杀伤小鼠肺腺癌细胞LA795,最高杀瘤率达到58.38±3.82%。结论利用特异性siRNA技术沉默Cbl-b基因能够促进小鼠T细胞因子IL-2和INF-γ分泌,增强T细胞对肺腺癌细胞LA795的体外免疫杀伤作用。

百合CBL1与CBL3基因的克隆与表达分析

为了深入研究百合响应盐胁迫的分子机制,研究以麝香百合杂种系品种‘白天堂’为试验材料,从中分离得到Ll CBL1与Ll CBL3基因,分别编码213和223个氨基酸。亚细胞定位分析表明Ll CBL1在细胞膜中表达,Ll-CBL3在细胞膜、细胞质和细胞核中表达。基因表达分析表明Ll CBL1和Ll CBL3在根、鳞茎、叶中均有表达; Ll-CBL1和Ll CBL3的表达受盐胁迫诱导,其中Ll CBL1响应盐胁迫的上调表达更加显著。研究结果表明Ll CBL1基因可能与百合的盐胁迫响应密切相关。

人cbl基因真核表达载体的构建及表达

目的 :构建带有flag标签的人cbl基因真核表达载体 ,并检测其在真核细胞中的表达 .方法 :以含有人全长cblcDNA的质粒pEFHAcbl为模板 ,采用PCR方法扩增cbl基因 ,并在其N 末端带上含 2 4bp的flag标签 ,克隆到 pGEM Teasy载体并测序 ,再亚克隆至真核表达载体 pcDNA3 1(+) ,酶切鉴定正确后采用脂质体法瞬时转染COS 7细胞 ,Westernblot检测flag cbl在细胞中的表达 .结果 :测序证实以pEFHAcbl为模板获得的flag cbl融合基因的序列以及读框全部正确 ;重组质粒 pcDNA3 1(+) flag cbl经酶切后产生与理论预期长度相符的片段 ;脂质体法转染COS 7后检测到预期目的蛋白的表达 .结论 :成功构建了N 末端带flag标签的cbl真核表达载体 ,并使其在真核细胞COS 7中表达 .

玉米ZmCBL2-2基因的克隆及其表达分析

为通过转基因植物等方法分析玉米ZmCBL2-2基因在耐逆性中的功能,运用RT-PCR(Reverse transcriptionPCR)方法克隆了该基因的编码区cDNA片段,并将其构建到植物表达载体p3301(pCAMBIA3301)上。同时,运用荧光实时定量PCR(Real-time quantitative PCR,RT-qPCR)技术对玉米幼苗期该基因在高盐、低温和养分缺乏等6种非生物胁迫下的表达动态进行了分析,发现其对于缺N、低K、低温、外源ABA(Abscisic acid)和水分胁迫均有显著的应答反应,而对于盐胁迫无明显的响应。

伴N-RAS及CBL突变的幼年型粒单核细胞白血病快速急变后单倍体移植1例报告并文献复习

目的减少对幼年型粒单核细胞白血病(JMML)的误诊,探讨单倍体造血干细胞移植治疗急变后未获得完全缓解JMML的可行性,并分析JMML快速急变的原因。方法 3岁患儿历经误诊为免疫性血小板减少症(ITP)和传染性单核细胞增多症后确诊为JMML,伴有N-RAS及CBL基因突变,但快速急变为急性髓细胞性白血病AML-M4型,伴有EVI1阳性表达。患儿接受母亲单倍体(HLA 7/10相合)造血干细胞移植,预处理方案为阿糖胞苷+白舒非+猪抗人T细胞免疫球蛋白+环磷酰胺,移植后采用环孢素A+霉酚酸酯(MMF)+短程甲氨蝶呤+甲基强的松龙方案预防移植物抗宿主病(GVHD)。结果移植后+14d白细胞植活,+18d血小板植活,未发生重度GVHD。移植后2个月减停全部免疫抑制剂,随访至2018年8月1日,患儿无病存活。结论 JMML急变后未获得完全缓解行单倍体造血干细胞移植治疗是可行的,同时存在N-RAS及CBL基因突变且有EVI1阳性可能是患儿快速急变的原因。

cbl-b基因转导淋巴细胞对人前列腺癌细胞LNCaP杀伤作用的实验研究

目的观察将cbl-b基因导入淋巴细胞能否增强其对人前列腺癌细胞LNCaP的杀伤作用。方法 cbl-b基因淋巴细胞组采用脂质体法将cbl-b基因导入淋巴细胞,在蛋白印记法证实导入基因成功表达后,再用CCK-8法检测其对前列腺癌的杀伤作用,并与正常人外周血中分离淋巴细胞组比较。结果 12h、24h、48h三个时间段,转基因淋巴细胞的杀伤率在10:1、20:1、40:1三种浓度与单纯淋巴细胞比较,杀伤率明显高于单纯淋巴细胞组,差异均有统计学意义(F分别=74.25、1745.90、1637.45,P均<0.05)。其中转cbl-b基因淋巴细胞组在10:1和40:1浓度时24h杀伤率明显高于12h、48h,差异均有统计学意义(t分别=18.37、36.00、17.25、35.21,P均<0.05),但12h、48h的杀伤率比较,差异无统计学意义(t分别=1.26、2.51,P均>0.05)。在20:1时12h杀伤率明显低于24h、48h,差异均有统计学意义(t分别=16.25、19.12,P均<0.05),但24h、48h的杀伤率比较,差异无统计学意义(t=1.06,P>0.05)。且在40:1转染24h杀伤作用最强,可达(44.16±0.67)%。结论转导入cbl-b基因可增强淋巴细胞对人前列腺癌细胞LNCaP的杀伤作用,且杀伤率最强的比例与时间段为40:1、24h。

乌拉尔甘草CBL基因家族的鉴定与表达分析

钙依赖磷酸酶B类似蛋白(Calcineurin B-like proteins,CBL)是植物特有的一类Ca~(2+)传感蛋白,在植物逆境应答及发育过程中发挥重要作用。为挖掘乌拉尔甘草CBL家族成员特征并预测CBL功能,利用生物信息学方法从乌拉尔甘草基因组中鉴定出10个CBL基因,命名为GuCBL1-GuCBL10,分别定位在10个不同的支架上。氨基酸序列比对发现,CBL家族成员在C-末端都含有4个与钙离子结合的EF-motif,部分CBL成员N端含有肉豆蔻酰化位点及棕榈酰化位点,预测可能与CBL蛋白的亚细胞定位有关。进化树分析显示,乌拉尔甘草CBL基因家族可分为4个亚家族,且各亚族中都包含拟南芥和大豆的CBL基因家族成员,说明它们具有高同源性。在乌拉尔甘草CBL基因的上游序列中,存在一些应答多种激素和逆境的顺式元件,预测CBL基因家族可能具有不同的生物学功能。组织表达分析表明,GuCBL在乌拉尔甘草根、茎和叶片中均有表达,在根中的表达量最高。荧光定量分析显示,在盐、氧化、干旱、高温和低温胁迫下,CBL家族基因受到不同程度的诱导,说明乌拉尔甘草CBL家族基因的表达与逆境胁迫响应之间的密切联系。该研究结果为深入理解CBL基因响应非生物胁迫的调控机制和解析其参与次生代谢物质累积的功能奠定基础。

玉米ZmCBL6基因的克隆及其植物表达载体构建

类钙调磷酸酶B蛋白(calcineurin B-like proteins,CBLs)是植物中1类重要的Ca2+结合蛋白,由其所介导的Ca2+信号途径广泛参与植物对多种非生物胁迫和某些生长发育信号的应答反应。本论文以水稻OsCBL6序列在GenBank数据库进行TBLASTN查询,获得其在玉米中推测的同源基因ZmCBL6的全长cDNA序列,然后用RT-PCR方法对ZmCBL6基因的编码框cDNA进行了克隆,用生物信息学方法对其编码蛋白的功能域、系统进化和亚细胞定位等进行了分析,并构建了其植物表达载体,为进一步研究其亚细胞定位和通过转基因植物等验证其功能奠定了基础。

西瓜CBL家族基因的鉴定与特征分析

CBL基因在植物逆境应答过程中具有重要作用,但在西瓜作物的抗逆育种研究中鲜有相关报道。该研究利用生物信息学的分析方法从已发表的西瓜全基因组中鉴定出7个CBL基因(ClaCBL1~ClaCBL7),并分析了它们在全基因组范围内的分布情况、分子结构特征、顺式元件以及系统进化等基本特征,为进一步研究西瓜CBL基因的功能提供参考。结果表明:西瓜CBL基因在全基因组中的分布是不均匀的,其中仅ClaCBL4基因有9个外显子,其余基因均为8个外显子,编码区序列大小在639~738bp。在进化上西瓜CBL基因分为3个不同的类群;它们编码区域内的氨基酸序列均含有能与CIPK互作的FSPF高保守性位点及能与钙离子结合的3个EF-hand结构;除了ClaCBL1预测定位在胞外基质中,其余的ClaCBL定位在细胞内的不同部位;在西瓜CBL基因启动子上游的序列中存在多个应答不同逆境和植物激素的顺式元件,而且CBL家族不同成员基因含有的顺式元件的种类和数目各不相同。上述分析显示,西瓜CBL可能参与多种生物学过程,而且不同成员存在功能上的分化。

三个新的大白菜CBL基因的鉴定和特征分析

利用大白菜已知CBL基因序列,在公共核酸数据库中重新搜索比对大白菜的基因组序列,鉴定出3个新的大白菜CBL基因,并对这3个基因的结构、遗传进化和顺式元件进行了分析,为进一步克隆和研究这些基因的功能提供了有益借鉴。

朝仓花椒CBL基因家族的鉴定及分析

通过NCBI BLAST分析,从朝仓花椒转录组中鉴定获得31条朝仓花椒类钙调磷酸酶B亚基蛋白(Calcineurin B-like protein,CBL)家族的编码基因序列,将其命名为ZpCBL 1-ZpCBL 31。对该基因家族进行分析发现,朝仓花椒的CBL基因家族在进化上可分为4组,每组成员数量分别为16、8、5、2。该家族蛋白等电点均小于7,偏酸性,且较多数为不稳定蛋白。多基因序列比对可知朝仓花椒CBL家族均具有至少1个高度保守的EF-hand结构域。对空间结构的分析发现,ZpCBL蛋白为多链折叠蛋白,以α螺旋为主。