影响CCID50法测定麻疹活疫苗效力的因素

对麻疹活疫苗效力测定ＣＣＩＤ５０法的某些影响因素如：滴定用细胞的敏感性、培养液的酸碱度、培养板放孵的温度等进行了试验分析。结果表明：１）滴定用细胞的敏感性对试验结果有显著影响。Ｖｅｒｏ细胞比ＦＬ细胞敏感得多（均差＝０．５０９ＬｇＣＣＩＤ５０／ｍｌ）。２）在用ＦＬ细胞滴定时，培养液的酸碱度及培养温度则对试验结果的影响不显著。３）在常规生产中，采用Ｖｅｒｏ细胞进行麻疹活疫苗的效力试验，提高了检定的敏感性和合格率。

CA16滴度微量检测方法的建立及其验证

目的建立用Vero细胞检测柯萨奇病毒A组16型（CAl6）滴度的方法，并对其适用性进行初步验证。方法通过对细胞种类的选择、细胞接种浓度和细胞病变判定时间的优化，建立测定CAl6滴度的半数细胞感染剂量法（CCID50法），并对其进行初步验证。结果通过对病毒感染后细胞病变情况的观察，确定了以Vero细胞作为CAl6病毒滴度检定用细胞。Vero细胞的最佳接种浓度和结果判定时间分别为5×10^4-1×10^5细胞／mL（即96孔板内每孔加入的最终细胞量为5×10^3-1×10^4细胞）和7d。由4组人员对6批CAl6病毒液进行重复检测，实验结果表明不同实验人员测定结果的变异系数（CV）在1．739％-4．974％之间，说明该方法测定结果重复性好，准确度高。结论该法简便、稳定，可以灵敏、准确地检测CA16病毒的滴度，可用于相关疫苗生产过程中的质量控制。

简谈应用病毒计数仪检测轮状病毒浓度

评价病毒计数仪定量检测轮状病毒的可行性。方法 将轮状病毒样品离心并使用组合染色剂染色后,采用InDevR(美国)公司的病毒计数仪检测其病毒浓度;并使用半数细胞感染剂量法(CCID50法)进行对比评价。结果 轮状病毒样品经过20倍稀释后回收率为105.4%-130.9%;不同实验人员在同一天的检测结果RSD值分别为5.8%和6.3%;相同实验人员在不同实验日期检测结果的CV值分别为8%和10%;相同样品不同方法检测时,发现CCID50法的检测结果的RSD范围为0.8%-6.4%,病毒计数仪检测结果的RSD范围为3.3%-17.7%,两种检测方法的结果进行配对T检验,P<0.05。结论 使用病毒计数仪检测时,低效价水平的检测值明显升高,该仪器日间精密度及重复性较日内差异较大(RSD>5%),应用病毒计数仪进行病毒浓度检测时,检测结果与传统的CCID50方法有显著差异(P<0.05),显示该仪器还需要进一步的改进,但是其检测时间短,操作简单,因而为轮状病毒浓度的定量检测提供了一种新途径。 。

CCID_(50)法检测流感病毒滴度方法的建立及验证

目的建立基于MDCK细胞的三价流感减毒活疫苗病毒滴度检测方法,并进行验证。方法以抗流感病毒血清中和三价流感减毒活疫苗中两种型别病毒,采用CCID_(50)法检测未中和型别病毒感染性滴度,并对方法的专属性、线性、准确性、精密度、耐用性进行验证。结果样品中的辅料成分、其他型别病毒和异源抗病毒血清均不会对病毒滴度测定结果产生干扰;该方法检测H1N1、H3N2和B型流感病毒滴度的线性范围分别为3.81~8.48、3.48~7.65和2.45~6.98 log CCID_(50)/0.2 ml,在线性范围内,线性回归系数(R^2)分别为1、0.994 6和0.994 5;该方法检测3种型别流感病毒滴度重复性和中间精密度的相对标准偏差(relative standard deviation,RSD)均小于15%,平均回收率在85%~115%之间;同一样品不同时间点检出结果差异无统计学意义(P均>0.05)。结论建立的CCID_(50)法专属性、准确度、线性、精密度、耐用性良好,是一种简便、快速、成本低、检测误差小的方法,可用于三价流感减毒活疫苗病毒滴度的检测。

鼠细小病毒感染性滴度测定方法的建立及病毒制备

目的建立鼠细小病毒(MMV)感染性滴度测定方法,并制备高滴度的MMV,为生物制品病毒清除/灭活工艺的验证奠定基础。方法通过分析NB324K细胞接种量、培养时间及病毒吸附时间等参数,建立MMV病毒滴度测定的半数细胞感染剂量法(CCID5)0,并分析其精密性;以A9细胞制备MMV,分析感染复数(MOI)、收获时间及收获样本对病毒滴度的影响,并检测病毒的稳定性。结果NB324K细胞的最佳接种浓度、培养时间及病毒吸附时间分别为5×103个/孔、48h及2h,所建立的检测方法精密性较好;A9细胞沉淀中病毒滴度高于上清,且随病毒MOI值的升高而逐渐增加,在MOI为10时,感染后48h收获,病毒滴度最高。制备的病毒液的平均滴度为8.69CCID50/ml,4℃和37℃保存7d及反复冻融5次,稳定性良好。结论已建立了MMV感染性滴度测定方法,并制备了高滴度的病毒,为以MMV为指示病毒进行病毒清除/灭活工艺验证奠定了基础。

影响轮状病毒半数细胞感染剂量法滴定的因素分析

目的:确定影响轮状病毒感染增殖过程的因素,以提高滴度检测结果的重复性和可靠性。方法:采用半数细胞感染剂量法(CCID50)结合ELISA(CCID50-ELISA)判断病毒在细胞上有无复制来检测病毒滴度。结果:不同细胞代次、接种浓度、培养时间、培养液种类和接种细胞孔数均会对病毒滴定结果造成显著影响。结论:轮状病毒滴度检测的线性和准确性与细胞状态与培养环境相关。CCID50-ELISA法检测轮状病毒滴度有良好的重复性和耐用性。

优化Ⅲ型脊髓灰质炎病毒在Vero细胞中的增殖条件

型脊髓灰质炎病毒经下游灭活工艺后抗原损失量较大,可以通过优化上游培养工艺来提高病毒产量。为研究病毒接种时间、感染复数(MOI)和病毒收获时间对Ⅲ型脊髓灰质炎病毒感染性滴度(CCID50)和D抗原的影响,优化Ⅲ型脊髓灰质炎病毒在Vero细胞中的增殖条件,为生产及毒种制备提供指导依据,本研究以接种胞龄和MOI为病毒接种的两个变量条件,以病毒滴度和D抗原含量为病毒收获液中病毒产量的判定指标。先固定MOI,在不同胞龄的Vero细胞上以相同MOI接种Ⅲ型脊髓灰质炎病毒,根据病毒收获液中病毒产量的结果筛选出产毒量最高的接种胞龄范围。然后以最佳产毒胞龄为固定条件,暨Vero细胞生长至96h^144h,以不同MOI接种病毒,进一步筛选出产毒量最高的MOI范围。结果显示,当MOI=0.003时,Vero细胞培养48h、72h、96h、120h和144h种毒组均在种毒后70h完全病变,Vero细胞培养120h种毒所得收获液D抗原含量和病毒滴度均为最高,分别为(331±31)DU/mL、(8.04±0.14)lgCCID50/mL。接种胞龄固定在96h^144h范围,当MOI为0.001、0.01和0.1时,细胞完全病变时间分别为81h、66h和55h,所得病毒收获液的D抗原含量分别为(301.1±13.8)DU/mL、(303.7±15.6)DU/mL和(272.6±19.6)DU/mL,滴度分别为(7.88±0.13)lgCCID50/mL、(7.58±0.14)lgCCID50/mL和(7.75±0.13)lgCCID50/mL。本研究提示,相同MOI下,不同细胞胞龄种毒后细胞达到完全病变时间相同;细胞培养至平台期前后接种Ⅲ型脊髓灰质炎病毒所获得的收获液D抗原含量和感染性滴度均最高;MOI影响Ⅲ型病毒病变进程,但对病毒产量影响不大;90%以上Vero细胞发生病变、脱落时为最佳收获病毒时间点。

甲型流感病毒在贴壁MDCK细胞上增殖条件的优化

目的确定甲型流感病毒在贴壁MDCK细胞上最佳增殖条件。方法将3株甲型流感病毒(H1N1 NYMC X-181、H1N1 NYMC X-275和H3N2 NYMC X-263B)在贴壁MDCK细胞上进行传代培养,以其血凝效价和半数细胞感染剂量(median cell culture infective dose,CCID50)为检测指标,分别对其增殖条件胰酶浓度(0.5、1.25、2.5、3.5和4.5μg/m L)、MOI(0.000 1、0.001、0.01、0.1、1)、培养温度(33、34、35、36、37℃)、吸附时间(0、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h)、培养时间(24、48、72、96、120 h)进行优化。结果 H1N1 NYMC X-181、H1N1 NYMC X-275和H3N2 NYMC X-263B 3株流感病毒在贴壁MDCK细胞上增殖的最适胰酶浓度分别为2.5、1.25、1.25μg/m L;最适MOI值均为0.01;最适培养温度均为34℃;最适吸附时间分别为1.5～2.0、1.5、1.5 h;最适培养时间均为72 h。结论确定了3株甲型流感病毒在贴壁MDCK细胞上的增殖条件,为后续相关疫苗的研发工作奠定了基础。