IL-21和CCL19修饰可提高NKP30 CAR-T细胞对肺癌的杀伤效率并促进其肿瘤浸润

目的探讨细胞因子IL-21和趋化因子CCL19修饰的NKP30 CAR-T细胞是否增强对肺癌的杀伤和浸润作用。方法在NKP30 CAR基础上融合基因IL-21和CCL19构建IL-21-CCL19 NKP30 CAR;CAR-T细胞的培养使用CD3CD28单抗及细胞因子IL-2刺激;流式细胞术检测免疫细胞表型;迁移实验检测IL-21对免疫细胞的迁移作用;乳酸脱氢酶(LDH)及成球实验检测CAR-T细胞的杀伤及浸润能力;酶联免疫斑点技术(ELISPOT)检测IFN-γ的分泌数量;ELISA检测IL-21及CCL19的分泌情况;体内实验中,将肿瘤细胞显微注射到斑马鱼卵黄囊,构建斑马鱼移植瘤模型,24 h后将免疫细胞注射至同样部位,体式荧光显微镜拍摄荧光。结果NKP30配体(B7H6)在正常组织及血液细胞不表达,在肺癌细胞上高表达(90%以上)。IL-21-CCL19 NKP30 CAR-T细胞与NKP30 CAR-T细胞和常规T细胞相比,具有更强的增殖能力、迁移能力及中心记忆T细胞的形成(P<0.001),免疫抑制分子CTLA4与PD1显著降低(P<0.005),对肺癌细胞具有更强的杀伤能力(P<0.001),伴随IFN-γ数量明显增加(P<0.001)。IL-21-CCL19 CAR-T细胞杀伤肺癌细胞中产生大量细胞因子IL‑21(3152.33±526.74 pg/mL)和趋化因子CCL19(1853±211.95 pg/mL)。体内实验中,CAR-T细胞和普通T细胞比较,具有较强的杀伤能力和增殖能力,但2种CAR-T细胞无明显差异(P>0.05)。结论IL-21-CCL19 NKP30 CAR-T细胞更容易浸润到肿瘤内部,有效杀伤肿瘤细胞,同时产生更多的记忆T细胞。

基线水平CCL19^(+)树突状细胞可有效预测肺腺癌患者免疫治疗的敏感性

目的探讨肺腺癌微环境基线水平CCL19^(+)树突状细胞(CCL19^(+)DC)与肺腺癌患者接受免疫治疗疗效及肺腺癌患者CD8^(+)T细胞浸润的相关性。方法回顾性分析2020年1月~2023年12月在河南科技大学第一附属医院住院的肺腺癌患者资料,并收集行免疫治疗的肺腺癌患者组织标本96例。应用免疫荧光法检测96例肺腺癌组织中CCL19^(+)DC及CD8^(+)T细胞的浸润状况。受试者工作特征(ROC)曲线评估基线水平CCL19^(+)DC对肺腺癌免疫治疗疗效预测价值,并进行敏感性分析。采用卡方检验分析肺腺癌组织中基线水平CCL19^(+)DC与免疫疗效及CD8^(+)T细胞浸润的相关性。采用Pearson相关性分析评价基线水平CCL19^(+)DC表达与细胞毒性T细胞(CTL)浸润相关性。将PC9肺腺癌细胞、CD8^(+)T细胞及DC(过表达CCL19和/或抗Pd^(-1)处理)进行分组体外共培养,采用流式细胞学方法检测T细胞各表面分子(GranzymeB、Perforin、IFN-γ、Ki-67)表达情况。结果免疫荧光结果显示,PR/CR组(Respond)的患者肺腺癌组织中CCL19^(+)DC浸润高于PD/SD组(Unrespond)患者,表现出更好的免疫治疗疗效,ROC曲线下面积为0.785,敏感度为75.6%,特异度为62.8%。CCL19^(+)DC高表达患者肺腺癌组CD8^(+)T细胞表面分子Granzyme B(P<0.01)、Perforin(P<0.01)、IFN-γ(P<0.01)及Ki-67(P<0.001)表达均高于CCL19^(+)DC低表达患者。肺腺癌组织基线水平CCL19^(+)DC的表达与免疫治疗疗效具有显著的相关性(P=0.003),与CTL细胞浸润呈正相关(r=0.6657,P<0.001),CCL19^(+)DC丰富度与CD8^(+)T细胞的浸润具有显著的相关性(P=0.007)。与对照组相比,转染过表达CCL19质粒及单独使用anti-PD1处理组中CD8^(+)T淋巴细胞杀伤及增殖功能标志物增加(P<0.01)。使用anti-PD1联合转染过表达CCL19质粒处理组中CD8^(+)T淋巴细胞杀伤及增殖功能标志物水平显著增加(P<0.001)。结论在免疫治疗背景下,肺腺癌微环境中基线水平CCL19^(+)DC的表达与肺腺癌患者免疫治疗疗效及CTL细胞浸润呈正相关,并且肺腺癌微环境中CCL19^(+)DC可以提升CD8^(+)T细胞杀伤及增殖功能标志物水平,发挥潜在抗肿瘤免疫作用。因此,肺腺癌微环境中基线水平CCL19^(+)DC可以有效预测肺腺癌免疫治疗的敏感性。

miR-325-3p通过CCL19基因调控非小细胞肺癌脑部转移的发展

目的:探索非小细胞肺癌患者发生脑部转移的分子机制。方法:采用2个独立的分析数据来源(GEO公共数据库芯片和临床募集非小细胞肺癌患者样本)寻找最为显著的差异基因和差异miRNA。定量PCR方法检测差异基因在非小细胞肺癌脑部转移患者和无脑部转移患者中的差异性。利用非小细胞肺癌细胞系A549,检测靶点基因对于肺癌细胞增殖、分化、凋亡以及侵袭的影响,并进一步研究下游分子通路。结果:与非小细胞肺癌无脑部转移患者相比,非小细胞肺癌脑部转移患者呈现352个差异性表达基因,其中CCL19基因差异性最显著(低表达,P<0.01)。CCL19是miR-325-3p的主要候选靶标。CCL19在非小细胞肺癌脑部转移组患者肺部组织中存在低表达,而miR-325-3p存在高表达。荧光素酶实验可以证实miR-325-3p直接调控CCL19的表达活性。miR-325-3p抑制剂转染后,A549细胞的侵袭、增殖和集落形成有了显著的降低(P<0.05),而细胞凋亡水平有了明显的增加。同时转染CCL19 siRNA可以有效地降低miR-325-3p抑制剂对于非小细胞肺癌细胞的调节功能。研究表明,CCL19主要通过调节下游Erk的磷酸化水平影响肺癌细胞功能调控。结论:初步证实,miR-325-3p作为致癌基因,通过调控CCL19的功能,继而影响下游Erk分子信号,最终控制肺癌细胞的侵袭、增殖和集落形成。

共表达IL-7/CCL19的新抗原反应性T细胞对小鼠肺癌的抗肿瘤研究

背景与目的新抗原反应性T细胞(neoantigen reactive T cell,NRT)具有抑制表达特异性新抗原的肿瘤生长的能力。然而,由于免疫浸润困难和肿瘤微环境的抑制,NRT在实体瘤中的治疗效果有限。本研究针对小鼠肺癌细胞设计出可以同时表达白细胞介素7(interleukin 7,IL-7)和趋化因子19(chemokine C-C motif ligand 19,CCL19)的NRT细胞(7×19 NRT),并对7×19 NRT细胞和常规NRT细胞的抗肿瘤效果差异进行了评估。方法针对小鼠Lewis肺癌细胞(Lewis lung carcinoma,LLC)进行了新一代测序和新抗原预测,制备了RNA疫苗,培养了NRT细胞,构建了编码IL-7和CCL19的逆转录病毒载体,转导NRT细胞并成功表达IL-7和CCL19,成功获得了7×19 NRT,并在小鼠体内外对其抗肿瘤效果进行了评估。结果7×19 NRT细胞通过分泌IL-7和CCL19显著增强T细胞的增殖和侵袭能力,在小鼠肺癌中实现了显著的抑瘤作用,延长了小鼠的生存期。经7×19 NRT治疗后,T细胞浸润肿瘤组织及肿瘤组织坏死显著增加。此外,7×19 NRT治疗与常规NRT治疗均安全。结论通过IL-7和CCL19的表达,NRT细胞的抗实体瘤能力显著增强,这是一种对NRT安全有效的基因修饰。

CCL19、高敏C-反应蛋白、IL-21联合检测对类风湿性关节炎并发心房颤动的早期诊断价值及护理对策

探索趋化因子配体19(CCL19)、高敏C-反应蛋白、IL-21联合检测对类风湿性关节炎并发心房颤动的早期诊断价值,以给出针对性护理对策。方法 回顾性分析2022年7月至2024年7月我院收治的138例类风湿性关节炎患者,其中并发心房颤动32例作为实验组,未发生心房颤动106例作为对照组。检测两组CCL19、高敏C-反应蛋白、IL-21,比较两组类风湿因子(RF)、抗环瓜氨酸肽抗体(ACPA);利用受试者工作特征(ROC)曲线,同时计算曲线下面积(AUC),判定血清高敏C-反应蛋白、IL-21、CCL19及三者联合检测对类风湿性关节炎并发心房颤动的诊断效能。结果 实验组类风湿因子(RF)、抗环瓜氨酸肽抗体(ACPA)高于对照组,差异有统计学意义(P <0.05)。实验组高敏C-反应蛋白、IL-21、CCL19高于对照组,差异有统计学意义(P <0.05)。经ROC曲线分析,三者联合诊断类风湿性关节炎并发心房颤动AUC为0.895,高于血清高敏C-反应蛋白、IL-21、CCL19单一诊断(AUC=0.732、0.626、0.773,P<0.05);三者联合诊断的灵敏度为74.86%,特异度为 90.67%。结论 血清高敏C-反应蛋白、IL-21、CCL19联合检测诊断类风湿性关节炎并发心房颤动的效能较高,可作为类风湿性关节炎并发心房颤动早期诊断的有效观察指标,宜指导临床护理开展早期干预。

趋化因子CCL19对体外培养人头颈鳞癌细胞活性的影响

目的:探讨趋化因子CCL19在人头颈鳞癌细胞活性中的作用。方法:应用噻唑蓝比色(MTT)法检测不同浓度顺铂对人头颈鳞癌原发细胞系(PCI-4A)及淋巴结转移细胞系(PCI-4B)的生长抑制作用,观察不同浓度的CCL19对顺铂作用的影响,应用透射电镜技术观察4B细胞形态学变化,流式细胞仪(FCM)检测CCL19对顺铂诱导的4B细胞周期及凋亡率的影响。使用SPSS11.0软件包进行统计学分析。结果:顺铂对4B细胞的生长抑制率高于4A细胞,CCL19可以显著降低顺铂对4B细胞的生长抑制(P<0.05),但对4A细胞无明显作用(P>0.05),CCL19对顺铂作用的4B细胞的影响是通过形态学上向正常状态转化、减少细胞在G1期的停滞、减少细胞的凋亡率而产生的。结论:顺铂在人头颈鳞癌淋巴结转移细胞(PCI-4B)中的作用强于原发细胞(PCI-4A),CCL19可以显著降低顺铂在PCI-4B细胞中的作用,提高细胞的活性,这为探讨临床头颈鳞癌的化疗耐药机制提供了一个新的思路。

NF-κB抑制剂PDTC对CCL19调控人头颈鳞癌细胞增殖活性的作用

目的探讨核因子κB(NF-κB)抑制剂吡咯烷二硫代氨基甲酸盐(PDTC)在CCL19调控人头颈鳞癌细胞活性中的作用。方法依次使用不同浓度PDTC、CCL19、顺铂处理人头颈鳞癌转移细胞PCI-37B,应用TransAMTM NF-κB p65试剂盒、噻唑蓝比色(MTT)、流式细胞仪等方法观察NF-κB活性变化,及其与细胞生长抑制、细胞周期、凋亡的关系。结果不同浓度PDTC可以使CCL19诱导的NF-κB活性显著降低(P<0.05),同时恢复CCL19作用后的细胞对顺铂化疗的敏感性,使细胞生长抑制率、细胞G1期比例、凋亡率等显著上升(P<0.05)。结论PDTC能阻断CCL19对人头颈鳞癌细胞活性的调控、促使细胞死亡。

剑尾鱼趋化因子CCL4和CCL19基因的克隆及嗜水气单胞菌感染对其组织表达的影响

趋化因子是一类能够吸引白细胞移行到感染部位的低分子量(8~10 ku)蛋白质,在炎症反应、非特异性免疫反应中具有重要作用。实验克隆了剑尾鱼2个趋化因子基因(CCL4、CCL19)c DNA序列,运用荧光定量PCR技术检测其在健康组织和嗜水气单胞菌感染后肝、脾中的表达情况。结果显示,剑尾鱼CCL4和CCL19开放阅读框长度分别为294和333 bp,分别编码97和110个氨基酸,推导氨基酸序列均含有趋化因子CC家族标志性的4个半胱氨酸残基,与其他物种尼罗罗非鱼、鼠、狗、人、鸡的氨基酸序列相似性比较,CCL4相似度分别为71.1%、33%、33%、31%、23.5%;CCL19相似度分别为62%、26.9%、24.5%、26.6%、27.8%。在检测的健康剑尾鱼8个组织中,CCL4和CCL19均有表达,其中CCL4和CCL19均在脾脏中表达量最高;CCL4在肌肉和肠中表达量较低,而CCL19则在心脏中表达量较低。经嗜水气单胞菌感染后,CCL4在剑尾鱼头肾中12 h表达量达到最高,在肝脏中24 h表达量最高;CCL19在头肾和肝脏中均在24 h时表达量最高。研究表明,趋化因子CCL4和CCL19可能参与剑尾鱼机体免疫调节反应,在抗嗜水气单胞菌感染过程中发挥了重要作用。

趋化因子CCL21、CCL19与急性冠状动脉综合征的相关性研究

目的:通过研究急性冠脉综合征(ACS)患者血清趋化因子CCL21、CC19的变化,探讨其与冠状动脉病变的相关性。方法:选取102例ACS患者,其中急性ST段抬高的心肌梗死(STEMI)患者33例,非ST段抬高的心肌梗死(NSTEMI)37例,不稳定型心绞痛(UA)患者32例,稳定型心绞痛患者36例,非心源性胸痛并经冠状动脉造影排除冠心病的患者为对照组30例,采用酶联免疫法法测定CCL21、CCL19水平,所有ACS患者进行冠状动脉造影用目测法和Gensini评分对冠脉血管进行损害程度进行评价,来探讨CCL21、CCL19与冠状动脉狭窄范围及程度的关系。结果:ACS组CCL21及CCL19水平明显高于稳定型心绞痛组和对照组,分别为[(149.33±26.24)ng/Lvs.(111.45±24.31)ng/Lvs.(108.38±22.28)ng/L,P<0.01],[(77.45±16.27)ng/Lvs.(54.74±19.44)vs.(57.38±21.28)ng/L,P<0.01]。ACS中STEMI、NSTEMI、UA组内血清CCL21、CCL19水平在组内差异无统计学意义[CCL21:(155.39±21.56)ng/Lvs.(154.38±20.74)ng/Lvs.(157.39±24.33)ng/L,P>0.05;CCL19:(75.34±15.34)ng/Lvs.(77.25±16.21)ng/Lvs.(74.23±24.19)ng/L,P>0.05],冠状动脉狭窄程度及Gensini评分法积分在ACS组内STEMI组、NSTEMI组、UA组比较差异无统计学意义,三组内冠状动脉狭窄程度与外周血CCL21、CCL19水平无明显相关性。结论:外周血CCL21、CCL19水平与急性冠脉综合症血管病变有关,在斑块不稳定中可能扮演着重要的角色。

HCV感染男性吸毒者血浆CCL19及CCL21浓度变化分析

目的:分析丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus,HCV)感染男性吸毒者血浆CCL19及CCL21浓度变化。方法:采用定量ELISA法检测血浆CCL19和CCL21浓度,ELISA法检测血浆抗HCV,Real-time RT-PCR法检测HCV RNA,以国家哨点监测HCV感染的391名男性吸毒者为研究对象,60名健康男性为对照,分析不同抗HCV/HCV RNA状况男性吸毒者血浆CCL19和CCL21浓度变化。结果:391名男性吸毒者中,180名感染HCV,感染率为46.04%。未感染HCV男性吸毒组血浆CCL19及CCL21浓度较健康男性组升高(P≤0.001)。吸毒抗HCV(-)/HCV RNA(+)组血浆CCL19和CCL21浓度最低,与其他组差异明显(P≤0.05);吸毒抗HCV(+)/HCV RNA(-)组的最高,与健康男性组差异显著(P<0.05)。结论:吸毒可使男性血浆CCL19和CCL21浓度升高。血浆CCL19和CCL21浓度升高可能有助于HCV自发清除;血浆CCL19和CCL21浓度降低可能预示着病程持续转归较差。

小鼠趋化因子CCL19Ig融合蛋白表达载体的构建、表达及鉴定

通过特异引物扩增出去掉终止密码的mCCL19编码序列,经酶切、亚克隆、拼接构建了真核表达载体pcDNA3.1-mCCL19Ig,酶切和测序鉴定插入序列;将重组质粒转染CHO细胞进行体外表达,通过RT-PCR、Western blot鉴定目的基因的表达,利用趋化小室法测趋化活性。结果测序证实重组表达载体含mCCL19编码序列和人IgG1 Fc段序列,其序列分别与GenBank中公布序列比对一致,IgG1 Fc段读码框未发生改变;Western blot结果证实转染了pcDNA3.1-mCCL19Ig的CHO细胞培养上清中有相对分子质量为38 000的融合蛋白mCCL19Ig表达;体外趋化实验表明融合蛋白mCCL19Ig对小鼠脾细胞有趋化活性,且呈剂量依耐关系。

不同传染性法氏囊病病毒株感染对CCL19-CCR7轴系表达量的影响

为了解不同毒株传染性法氏囊病病毒(IBDV)对CC类趋化因子配体CCL19及其受体CCR7基因表达量的影响,探明趋化因子在IBDV致病中的作用,本试验分别用经典毒株CJ801和本地分离毒株HN-1对SPF鸡进行攻毒,攻毒成功后取法氏囊提取总RNA,反转录后荧光定量分析,检测CCL19-CCR7轴系基因mRNA表达水平的差异。结果显示,经典毒株CJ801攻毒后,趋化因子CCL19及其受体CCR7基因mRNA表达量均于1d时达峰值,3d时显著下降低;而本地分离毒株HN-1攻毒后,趋化因子CCL19及其受体CCR7基因mRNA表达量于1d、3d和5d逐步上升。结果表明,在IBDV经典毒株CJ801和本地分离毒株HN-1感染过程中,CCL19及其受体CCR7基因表达量差异显著,其对T细胞迁移和IBDV复制的影响机制有待进一步探索。

P1/Fas-CCL19双表达重组腺病毒载体的构建及表达鉴定

目的利用pAdEasy-1腺病毒包装系统构建血型B抗原模拟多肽P1/Fas-CCL19双表达重组腺病毒,并在体内外试验中验证其表达及可能的疗效。方法应用腺病毒穿梭质粒pShuttle-CMV、骨架质粒pAdEasy-1构建重组腺病毒质粒pAd-CMV-P1/Fas-CCL19并转染至HEK293A细胞,获得重组腺病毒Ad-P1/Fas-CCL19颗粒后进一步感染乳腺癌4T1细胞并鉴定转染4T1细胞内P1/Fas-CCL19mRNA和蛋白质的表达。构建经人B型血红细胞免疫的4T1荷瘤小鼠模型,比较瘤内注射重组腺病毒Ad-P1/Fas-CCL19组、空腺病毒组、0.9%氯化钠溶液组的荷瘤小鼠的肿瘤变化及生存期。结果感染后4T1细胞中P1/Fas-CCL19 mRNA和蛋白质均有表达。瘤内注射重组腺病毒Ad-P1/Fas-CCL19较瘤内注射空腺病毒、0.9%氯化钠溶液明显抑制4T1肿瘤的生长,但三组小鼠的生存期无明显区别。结论 P1/Fas-CCL19重组腺病毒载体成功构建,体内外实验均证明了其稳定表达及有效性,为进一步临床研究奠定了基础。

人CCL19基因重组腺病毒载体的构建及其在A549细胞中的表达

目的:构建人CCL19重组腺病毒,在肺癌细胞株A549中验证其表达情况。方法:通过pAdeasy-1系统,获得重组腺病毒Ad-CCL19颗粒,测定病毒滴度。RT-PCR和Western blot分别检测转染A549细胞内CCL19mRNA和蛋白质的表达。结果:经PCR、双酶切鉴定及测序分析,重组腺病毒构建成功;效价为1.2×1011pfu/mL;感染后A549细胞中CCL19mRNA和蛋白质均有表达。结论:成功构建CCL19重组腺病毒载体,并可在A549细胞中有效表达,为进一步研究CCL19的功能奠定了基础。

类风湿关节炎血清中CCL19和CCL21的表达水平与肺间质病变的关系

目的:探讨趋化因子CCL19和CCL21在类风湿关节炎(RA)患者血清中的表达水平与肺间质病变之间的关系,以及与临床指标间的相关性。方法:收集2016年5月至2017年3月于中国医科大学附属第一医院住院的RA患者62例,其中肺间质未受累的34例,合并肺间质改变的28例,特发性间质性肺炎(IIP)患者18例,以健康正常人20例为对照组。ELISA测定血清中的CCL21和CCL19水平。采用单因素方差分析,LSD-t检验,Kruskal-Wallis检验,Pearson和Spearman相关分析等进行统计分析。结果:RA患者血清中的CCL21和CCL19水平均高于正常人(P<0.05;P<0.01),合并间质性肺炎(ILD)的RA患者血清中CCL21浓度高于无ILD的RA,高于正常人(P<0.05;P<0.01);IIP患者血清中的CCL21水平比正常人高(P<0.01);男性血清中的CCL21水平高于女性(P<0.05);RA患者血清中CCL21水平与白蛋白和BMI负相关(r=-0.280,P<0.05;r=-0.605,P<0.05);CCL19水平与C4水平负相关(r=-0.326,P<0.05),与D-二聚体水平正相关(r=0.592,P<0.05)。结论:趋化因子CCL21和CCL19在RA患者血清中高表达,可能参与了RA的发病过程,其中CCL21可能还参与了RA的肺间质受累过程。

沉默CCL19对结直肠癌增殖、迁移、侵袭和促血管形成的影响

目的研究趋化因子CCL19在结直肠肿瘤中的作用。方法采用Real—TimePCR和Westernblotting技术筛选高表达CCL19的细胞株SW620细胞作为研究对象，并用siRNA沉默SW620中的CCL19基因。分别采用细胞增殖实验、Transwell迁移、侵袭实验和小管形成实验来检测SW620细胞的增殖、迁移、侵袭和促血管形成能力的变化。结果Westernblotting和Real—TimePCR证实SW620中CCL19相对其他细胞株高表达。经siRNA-CCL19干扰后，SW620细胞在48～120h内细胞增殖能力显著上升（P〈0．05），细胞迁移、侵袭能力亦明显上升（P〈0．05），促血管形成能力明显增强。结论SW620是相对高表达CCL19的细胞株，沉默CCL19基因后可以明显促进SW620细胞在体外的增殖、迁移、侵袭和促血管形成能力，因此认为CCL19在结直肠癌发展中起着抑制作用，并有应用于抗癌药物研究的前景。

趋化因子CCL19在结直肠癌中的表达和作用

目的观察趋化因子CCL19在结直肠癌组织中的表达,探讨其对结直肠癌细胞的增殖、迁移、侵袭能力的影响。方法收集确诊为结直肠恶性肿瘤并手术切除患者(n=85)的肿瘤组织及癌旁正常组织,运用实时定量PCR和组织微阵列免疫组化技术检测CCL19的表达水平;以实时定量PCR、蛋白质印迹技术筛选高表达CCL19受体CCR7的人结直肠癌细胞株SW620细胞作为研究对象,并给予重组人CCL19(rh-CCL19)刺激,通过细胞增殖实验、划痕实验、Transwell实验来检测SW620细胞的增殖、迁移和侵袭能力的变化。结果结直肠癌组织中的CCL19表达要明显低于癌旁正常组织(P<0.05),且CCL19表达量与肿瘤大小和浸润深度有关(P<0.01)。在CCR7高表达的SW620细胞中,加入rh-CCL19后,其细胞增殖、迁移及侵袭能力下降(P<0.05)。结论 CCL19在结直肠癌组织中的表达量低于癌旁正常组织,且与肿瘤大小和浸润深度有关;CCL19可抑制人结直肠癌细胞株SW620细胞增殖、迁移和侵袭能力,提示CCL19具有抑制结直肠癌的作用。

绵羊CCL19基因启动子活性分析及其转录调控元件筛选

【目的】鉴定绵羊趋化因子C-C基序配体19(C-C motif chemokine ligand 19,CCL19)基因启动子的核心启动子区域和关键转录因子,探究该基因在转录调控方面的作用机制。【方法】选取绵羊CCL19基因5′-侧翼序列1000 bp,PCR扩增启动子的7个不同长度的截短片段,并连接至pGL3-Basic质粒;将重组质粒与pRL-TK质粒共转染到293T细胞中,结合双荧光素酶报告基因检测系统分析不同截短片段的相对荧光活性。利用在线预测软件分析和筛选CCL19基因核心启动子区域内的转录因子结合位点。采用定点突变技术构建转录因子结合位点缺失的荧光素酶报告载体,与pRL-TK质粒共转染到293T细胞,分析转录因子结合位点缺失质粒的相对荧光活性。【结果】成功构建了7个不同长度(pGL3-P、pGL3-P1、pGL3-P2、pGL3-P3、pGL3-P4、pGL3-P5及pGL3-P6)的CCL19基因启动子片段的荧光素酶报告载体;采用双荧光素酶报告基因检测系统鉴定出转录起始位点上游-256/-186 bp为CCL19基因启动子核心启动子区域,表明该区域对CCL19基因转录调控有重要作用。生物信息学分析预测到该区域存在POU5F1(-201/-189 bp)、ZBTB26(-228/-217 bp)、FOXI1(-239/-228 bp)、GLI2(-255/-243 bp)和SP2(-219/-211 bp)5个转录因子的结合位点,并成功构建了转录因子结合位点缺失的荧光素酶报告载体。双荧光素酶报告基因检测系统分析显示,POU5F1转录因子的结合位点缺失后绵羊CCL19基因转录活性极显著降低(P<0.01),FOXI1、ZBTB26、SP2转录因子结合位点缺失后绵羊CCL19基因转录活性均极显著升高(P<0.01)。【结论】试验成功构建CCL19基因启动子荧光素酶报告载体,确定CCL19基因启动子的核心启动子区域为转录起始位点上游-256/-186 bp,并鉴定出转录因子POU5F1结合位点可能是CCL19基因转录的重要调控位点,为下一步研究绵羊CCL19基因在先天性免疫、适应性免疫和淋巴细胞迁移等方面的功能提供理论基础。

CCL19下调β-链蛋白、细胞周期蛋白D1抑制结肠癌

目的:研究趋化因子CCL19对SW1116结肠癌细胞增殖、周期及5-FU疗效的影响。方法 :构建慢病毒LV5-CCL19转染结肠癌细胞株,获得过表达CCL19结肠癌细胞株——SW1116-CCL19。通过细胞增殖实验(CCK-8法)、流式细胞技术、裸鼠体内成瘤实验,分别检测上调CCL19后对SW1116细胞增殖、细胞周期的影响。Western印迹检测细胞内β-链蛋白(β-catenin)、细胞周期蛋白D1(cyclin D1)表达。不同浓度5-FU处理细胞,检测处理后细胞存活率。结果:CCL19上调组SW1116细胞较阴性对照组及空白对照组增殖受抑,同时上调CCL19亦可将细胞周期阻滞在G1期。Western印迹显示CCL19上调组肠癌细胞内β-catenin、cyclin D1较阴性对照组明显降低。上调CCL19可抑制裸鼠皮下肿瘤生长。5-FU作用后,CCL19上调组细胞存活率较阴性对照组降低。结论:CCL19可通过抑制β-catenin、cyclin D1的表达抑制结肠癌的发生发展,提高5-FU的抗肿瘤疗效。

共表达细胞因子IL-7和趋化因子CCL19/CCL21的第4代anti-CD19 CAR-T细胞的开发与应用

目的初步探讨共表达细胞因子IL-7和趋化因子CCL19或CCL21的anti-CD19 CAR-T细胞的功能特性及其在体外对人CD19^+急性淋巴细胞白血病(B-ALL)的杀伤效果,旨在优化CAR-T细胞各项功能,增强其对血液瘤、实体瘤的治疗效果。方法通过亚克隆技术获得重组慢病毒质粒,慢病毒包装,转导原代T细胞获得2种第4代anti-CD19CAR-T细胞,分别命名为7×19 CAR-T细胞、7×21 CAR-T细胞。借助流式细胞仪和相关试剂盒检测了细胞CAR分子的转导效率、CAR-T细胞的趋化能力、增殖及凋亡情况等;钙黄绿素释放法检测CAR-T细胞的杀伤作用;共培养法检测CAR-T细胞因子的释放情况;2种第4代anti-CD19 CAR-T细胞组皆于原代T细胞、常规anti-CD19 CAR-T细胞作比较。结果7×19 CAR-T、7×21 CAR-T细胞的功能特性皆有显著提高,主要表现在细胞增殖速度加快、细胞凋亡速率明显变慢、炎症因子IFN-γ、肿瘤坏死因子TNF-α的分泌量皆有所增加;且体外杀伤实验表明阳性率约40%的7×19 CAR-T、7×21 CAR-T细胞对CD19^+肿瘤细胞Raji的杀伤效率高于阳性率约50%anti-CD19 CAR-T细胞(P<0.01);结论实验数据显示共表达细胞因子IL-7和趋化因子CCL19或CCL21的第4代anti-CD19 CAR-T细胞即7×19 CAR-T和7×21 CAR-T细胞相比第3代anti-CD19 CAR-T细胞和T细胞在趋化能力、细胞增殖、细胞凋亡、体外杀瘤效果以及细胞炎症因子的释放能力等方面皆有显著改善,初步证明了7×19 CAR-T细胞和7×21 CAR-T细胞的各项功能有所优化,对CD19^+人急性淋巴细胞白血病治疗效果得到改善,为开发靶向CD19的新型CAR-T细胞提供了新思路,这种模式也为其它类型CAR-T细胞的开发开创了典范。