趋化因子CCL28过表达对人乳腺癌细胞增殖的影响

背景与目的:CCL28,又称为黏膜相关上皮趋化因子(mucosa-associated epitheliachemokine,MEC),是趋化因子CC家族中的一员。研究表明,CCL28与肿瘤发生、发展有关,但对其在乳腺癌中的功能还知之甚少。本文旨在探讨CCL28过表达在体外对乳腺癌细胞MDA-MB-231增殖的影响。方法:构建CCL28过表达载体pBabe-CCL28表达质粒,将重组的pBabe-CCL28基因和空载体pBabe转染细胞Phoenix,利用逆转录病毒感染乳腺癌细胞MDA-MB-231,通过嘌呤霉素药物筛选获得稳定表达CCL28的MDA-MB-231/CCL28细胞系和感染空载体的MDA-MB-231/vector细胞系,利用半定量RT-PCR、实时荧光定量PCR及蛋白质印迹法(Western blot)检测CCL28的基因表达和蛋白质水平;利用CCK8、软琼脂克隆培养及流式细胞术检测CCL28过表达后细胞增殖、克隆形成能力及凋亡的变化;利用Western blot检测CCL28过表达后凋亡相关蛋白的变化。结果:成功建立了稳定表达CCL28的细胞系MDA-MB-231/CCL28,与空载体对照组相比,pBabe-CCL28质粒感染入细胞后CCL28基因表达水平明显增高,说明CCL28 cDNA重组质粒构建成功。CCK8及软琼脂克隆实验结果显示,MDA-MB-231/CCL28的增殖能力明显高于MDA-MB-231/vector,差异有统计学意义(P<0.05)。流式细胞术结果显示,MDA-MB-231/CCL28细胞凋亡比例减少,差异有统计学意义(P<0.05)。Western blot结果显示,抗凋亡蛋白Bcl-2的表达增加。结论:CCL28过表达可以显著促进人乳腺癌细胞MDA-MB-231的增殖能力,抑制乳腺癌细胞凋亡,后者可能与Bcl-2上调有关。CCL28有望成为临床治疗乳腺癌的潜在基因靶点。

兔CCL28基因的克隆与序列分析

克隆并分析兔CCL28基因。基于电子延伸序列,设计1对克隆引物,兔盲肠黏膜组织提取总RNA,进行RT-PCR,将PCR产物与pMD19-T载体连接后转化E.coliJM109感受态细胞、检测阳性克隆、测序并进行序列分析。克隆的兔CCL28基因片段长为133 bp,编码由44个氨基酸残基组成的CCL28前体蛋白,克隆的兔CCL28基因与绵羊、野猪的同源性分别为76.7%、77.4%,推导的氨基酸序列与绵羊、野猪的同源性分别为56.8%、56.8%,结构特征与绵羊、野猪的相一致。并注册GenBank(Accession.EU727201)。

牛源CCL28基因克隆、生物学特性及mRNA表达分析

为了探究牛趋化因子CCL28基因编码蛋白的生物学特性及其mRNA在奶牛不同器官中的表达水平,试验采用PCR方法扩增并克隆奶牛CCL28基因CDS全长序列;通过生物信息学软件对其编码蛋白进行分析并构建系统进化树;应用实时荧光定量PCR方法检测CCL28基因mRNA在奶牛不同器官中的表达情况。结果表明:CCL28基因编码蛋白是一种结构较不稳定、带正电的亲水性蛋白,由129个氨基酸组成;牛CCL28基因核苷酸序列与绵羊的同源性较高,达到94.3%,与绵羊的遗传距离较近;CCL28蛋白的二级结构主要由无规则卷曲和α-螺旋构成,主要存在于细胞外,可能与CCR10、CCR3、ACKR2等蛋白存在互作关系;平均信号肽分值为0.901,没有跨膜结构域;CCL28基因mRNA在奶牛多个器官中均有表达,其中乳腺中的表达量极显著高于其他器官(P<0.01),肝脏和肾脏次之。说明CCL28基因可能在乳腺组织免疫过程中发挥调控作用。