死亡受体6在食管癌中表达及其与CCN1的关系研究

目的:研究死亡受体6(death receptor 6,DR6)在食管癌中的表达及细胞基质分子(cellular communication network factor 1,CCN1)对DR6表达的影响,寻找新的分子靶点,为食管癌的治疗提供帮助。方法:通过Real-Time PCR、免疫组织化学及Western Blot方法,分析食管肿瘤中DR6、细胞基质蛋白CCN1在食管癌中的表达,并通过细胞转染实验分析CCN1对DR6表达的影响。结果:DR6 mRNA在食管肿瘤细胞系中较食管正常上皮细胞表达升高(P<0.05);Western Blot及免疫组织化学分析显示DR6、CCN1在食管癌中均有表达,且在食管鳞状细胞癌中表达升高(P<0.05);CCN1上调了食管鳞癌、腺癌细胞株DR6的蛋白表达(P<0.05)。结论:在食管鳞状细胞癌中DR6、CCN1表达高于正常上皮细胞,可能参与食管鳞状细胞癌发生、发展。CCN1可以影响DR6的表达,进而可能影响DR6的生物学功能。

CCN1基因肺特异性条件敲除小鼠模型的构建和鉴定

目的:构建Cre重组酶系统调控的肺特异性的富半胱氨酸血管生成诱导因子61(CYR61,又称CCN1)基因条件敲除小鼠,为肺组织内CCN1在炎症中扮演的角色和作用机制的体内实验研究提供更特异的动物模型。方法:将引进的CCN1^(flox/flox)转基因小鼠和肺上皮细胞特异性表达Cre重组酶工具鼠分别进行繁殖和鉴定,然后将2种小鼠进行杂交并对其子代小鼠的基因型进行鉴定,其子代基因型为Cre^(+/-)CCN1^(flox/flox)的小鼠为本研究所构建的肺上皮细胞特异性CCN1基因条件敲除小鼠。结果:Cre^(+/-)CCN1^(flox/flox)的小鼠被成功繁殖并鉴定。使用他莫昔芬腹腔注射处理Cre^(+/-)CCN1^(flox/flox)实验组及Cre^(-/-)CCN1^(flox/flox)对照组,分别使用RT-PCR、免疫荧光、免疫组织化学、Western blot检测肺组织中CCN1的mRNA和蛋白表达,与对照组比可见实验组肺组织中CCN1的mRNA和蛋白表达均明显下降。结论:本研究基于Cre-Lox P技术成功构建了肺上皮细胞特异性CCN1基因条件敲除小鼠,并能稳定传代,可为进一步研究CCN1在肺组织内炎症中调控作用和机制奠定了动物模型的基础。

过表达外源性CCN1对人骨肉瘤细胞系143B生长和迁移的影响

采用AdEasy系统构建带有标记基因GFP和FC的重组腺病毒AdCCN1,并感染人骨肉瘤细胞,观察外源性CCN1对肿瘤细胞生长和迁移的影响.PCR扩增FC编码序列标记的人CCN1,克隆到pAdTrack-TO4中获得重组穿梭载体pAdTrack-CCN1.PmeⅠ线性化该质粒并电转到有腺病毒骨架质粒的BJ/AdEasy-1菌中,同源重组获得腺病毒质粒pAdCCN1,PacⅠ线性化并转染293细胞,包装制备AdCCN1.卡那霉素抗性筛选、XbaⅠ与KpnⅠ酶切鉴定,荧光显微镜和Western印迹检测标记基因GFP和FC表达,鉴定获得的复制缺陷型重组腺病毒AdCCN1.AdCCN1与AdGFP分别感染人骨肉瘤细胞143B,通过MTT实验、胶原集落形成实验、划痕愈合和室移动实验,观察CCN1对143B增殖和迁移的影响.酶切鉴定表明,带有FC标记的CCN1被成功克隆到穿梭载体pAdTrack中.卡那霉素抗性筛选并酶切鉴定,获得重组腺病毒质粒pAdCCN1.Western印迹和荧光显微镜观察,确定与CCN1共表达的FC和GFP表达.AdCCN1感染骨肉瘤细胞,与对照比较细胞数量增多,集落形成增加,细胞划痕逐渐愈合,迁移至膜上的细胞数量明显增加.应用AdEasy系统高效快速构建了带有标记GFP和FC的重组腺病毒AdCCN1,为监控腺病毒转基因的效果提供了便捷的工具.AdCCN1感染骨肉瘤细胞后可促进细胞增殖和迁移,提示CCN1在肿瘤发生和转移中可能起到重要作用.

慢病毒介导的CCN1基因对大鼠骨髓间充质干细胞生长和迁移的影响

目的:探讨外源性CCN1对大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)生长和迁移的作用。方法:构建带有绿色荧光蛋白的大鼠CCN1慢病毒载体(Lenti-GFP-CCN1)并感染大鼠BMSCs,筛选最适感染复数(MOI);实验分为空白组、感染Lenti-GFP组和感染Lenti-GFP-CCN1组,倒置荧光显微镜下观察BMSCs感染后荧光表达情况;MTT法检测细胞存活率,划痕愈合实验检测细胞迁移作用。结果:与空白组和阴性对照组相比,Lenti-GFP-CCN1感染大鼠BMSCs后,细胞的存活率未见明显差异;感染组细胞划痕愈合实验的愈合宽度/原宽度值与空白组及阴性对照组相比差异显著(P<0.05)。结论:外源性CCN1对正常大鼠BMSCs存活率无影响,可促进BMSCs迁移。

CCN1基因在肾癌组织中的表达及其意义

目的研究CCN1基因在人肾癌组织中的表达变化,初步探讨其与肾癌发生的关系。方法对42例开放手术切除的肾癌组织标本进行免疫组织化学染色,应用IPP图像分析软件对染色结果进行定量分析;运用RT-PCR技术检测肾癌组织标本中CCN1mRNA的表达,应用Quantity one图像分析软件对RT-PCR结果进行定量分析。18例距离癌区2cm以上的正常肾组织标本作为对照组,均经病理检查证实为正常组织。结果免疫组织化学结果显示CCN1基因在肾癌组织及正常肾组织中均有表达,但其在肾癌组织中的表达强度显著高于正常肾组织(P<0.01)。RT-PCR结果显示肾癌组织中CCN1mRNA的表达显著多于正常肾组织(P<0.01)。结论 CCN1基因在肾癌组织中表达增高,可能与肾癌的发生有重要关系。

过表达外源性CCN1对大鼠放创复合伤愈合的影响

目的观察过表达外源性CCN1对大鼠放创复合伤愈合的影响,并初步探讨其机制。方法利用AdCCN1感染CHO细胞及放创复合伤大鼠创面,Western blot法鉴定CCN1在CHO细胞的分泌和创面组织细胞中的表达,感染后7d取创面组织制作石蜡切片,HE染色观察创面愈合情况,免疫组化检测MMP1、TIMP1、bFGF等创伤愈合相关因子表达。结果 CCN1在CHO细胞和创面组织中均高表达,与AdRFP组相比,AdCCN1组创面成纤维细胞增多,微血管密度增高,MMP1、TIMP1、bFGF等创伤愈合相关因子表达均升高。结论 CCN1具有促进放创复合伤愈合的作用,其机制可能与CCN1促进成纤维细胞增殖和迁移,促进血管形成,并且调控创伤修复相关因子表达有关。

CCN1在系统性红斑狼疮患者血清中的变化

目的通过检测系统性红斑狼疮(SLE)患者血清中CCN1/CYR61(cysteine-rich 61)的水平,探讨其水平变化在SLE、狼疮肾炎发病过程中的作用及与疾病活动的相关性。方法采用酶联免疫吸附法检测SLE患者(n=70)和正常对照组(n=20)血清CCN1水平,收集被检者同批次实验室指标,计算SLE活动指数(SLEDAI),进行统计分析。结果 SLE患者血清CCN1水平高于正常对照组(P<0.05)。SLE肾脏损伤组血清CCN1水平高于肾脏非损伤组(P<0.05);SLE患者血清CCN1水平与抗双链DNA抗体、24 h尿蛋白定量、尿微量白蛋白呈正相关(r=0.507,P<0.05;r=0.552,P<0.05;r=0.506,P<0.05);与补体C3、C4呈负相关(r=-0.591,P<0.05;r=-0.433,P<0.05);与尿常规中高倍镜下红细胞计数、尿蛋白、SLEDAI评分无明显相关性(r=0.185,P>0.05;r=0.265,P>0.05;r=0.199,P>0.05)。结论 SLE患者血清CCN1水平高于正常对照组,与实验室指标相关,推测CCN1可能参与SLE的发病过程,介导局部炎性反应,与淋巴细胞、成纤维细胞异常凋亡有关,但尚不能确定可否作为疾病活动指标。

CCN1与肝癌的研究进展

最新统计数据表明，肝癌发病率居全球肿瘤的第5位，然而仅我国肝癌年发病例数就占全世界的55％，且新发病例数仍在逐年增加。复发和转移是肝癌等恶性肿瘤的突出特点，也是治疗的难点。CCN1是结缔组织生长因子家族中的一员，迄今为止，人们已经发现了6种CCN家族成员，分别为CCN1～6。

β-catenin/CCN1在肝纤维化患者肝组织中的表达

目的研究β-catenin/CCN1在肝纤维化患者肝组织中的表达及其在肝纤维化过程中的作用。方法免疫组织化学检测肝纤维化患者及正常对照组肝组织中β-catenin、CCN1、α-SMA的表达情况。统计学分析β-catenin与CCN1的相关性。结果肝纤维化患者肝组织中β-catenin、CCN1的表达明显增高,主要表达在α-SMA阳性的纤维间隔周围的肝细胞,其中部分肝细胞β-catenin发生入核移位;相关性分析结果显示,肝纤维化患者肝组织中肝细胞表达β-catenin与CCN1呈正相关。结论在肝纤维化的发生过程中,纤维间隔周围肝细胞通过β-catenin上调CCN1参与肝纤维化的发生发展。

辐射对L929细胞生长及CCN1基因表达的影响

目的通过观察辐射对小鼠皮肤成纤维细胞系L929生长及CCN1基因表达的影响,探讨CCN1基因与辐射损伤的关系。方法体外培养L929细胞系,以4Gy60Coγ射线照射为辐射组,并设对照组,MTT法测细胞增殖变化,平板克隆形成实验检测克隆形成能力,流式细胞术测细胞周期,RT-PCR及免疫细胞化学法检测L929细胞中CCN1基因的表达情况。结果辐射组细胞辐照2d增殖抑制明显(P<0.01),克隆形成也明显受到抑制(P<0.05);辐射后24h,细胞出现G2期停滞;辐射后6hL929细胞CCN1的mRNA表达水平明显降低(P<0.01),至24h开始回调(P<0.05);辐照后24～48h,细胞CCN1蛋白的表达水平明显下降(P<0.01)。结论因辐照生长受到抑制的小鼠成纤维细胞L929,其CCN1基因的表达水平下调,提示CCN1基因的表达水平低下是辐射导致细胞生长抑制的因素之一。

富含半胱氨酸蛋白61(CYR61/CCN1)与风湿病关系的研究进展

富含半胱氨酸蛋白61(CYR61/CCN1)在人体细胞中广泛表达,但在不同器官、细胞中表达存在明显差异,具有调节细胞外基质形成,影响细胞增殖、趋化、黏附、凋亡等作用,与骨形成、血管发生、组织炎症及修复密切相关,在肿瘤、心血管、发育领域研究深入。CCN1在类风湿性关节炎、干燥综合征、系统性硬化症、系统性红斑狼疮、骨关节炎等风湿病患者血清或组织中差异表达,参与介导炎症因子产生,炎细胞浸润,成纤维细胞样滑膜细胞增殖,软骨成熟、分化,血管生成等过程,与疾病活动度显著相关,且在不同机制信号通路中发挥作用。

感觉神经肽P物质通过调控CCN1的表达促进人牙周膜细胞增殖

目的探讨感觉神经肽P物质(SP)对人牙周膜细胞(hPDLCs)增殖的作用及调控机制。方法从因正畸需要拔除的前磨牙中分离hPDLCs,用浓度为0、10-1nM、101nM、103nM、104nM、105nM和106nM的SP干预h PDLCs,于干预后的0 h、1 h、2 h、4 h、8 h、12 h及24 h检测细胞增殖及组蛋白去乙酰化酶(HDAC)活性。此外,用HDAC抑制剂对h PDLCs预干预30 min后,再采用104nM的SP干预8 h,检测组蛋白H3乙酰化和磷酸化以及高半胱氨酸血管生成诱导因子61(CCN1)的表达。结果 104nM的SP干预4 h后可显著增加hPDLCs细胞的增殖及HDAC的活性(P <0. 05),且在干预8 h时均达到峰值。10~4nM和10~5nM浓度的SP干预8 h可显著促进hPDLCs细胞的增殖(P <0. 05)。SP的浓度与HDAC的活性正相关。HDAC抑制剂可逆转SP诱导的组蛋白H3去乙酰化和去磷酸化作用,阻断SP诱导的CCN1表达的增加(P <0. 05)。结论 SP可通过激活HDAC,导致组蛋白H3去乙酰化和去磷酸化,促进CCN1的表达,进而增加hPDLCs细胞增殖,修复牙周组织。

外源性CCN1促进辐射损伤L929细胞的生长和迁移

目的观察外源性CCN1是否促进辐射损伤L929细胞生长和迁移,以探讨CCN1在放创复合伤修复中的作用。方法以4Gyγ射线辐射L929细胞作为辐射损伤细胞模型,细胞辐射后分别加入2mlCCN1或RFP条件培养液,37℃,5%CO2培养,作为CCN1组和RFP组;空白条件培养液培养辐射损伤L929细胞作为空白组。各组进行MTT试验、平板克隆形成试验、细胞周期分析和划痕愈合试验。结果与RFP组和空白组相比,CCN1条件培养液处理后,与空白组辐射损伤L929细胞增殖明显增强(P<0.05),与RFP组和空白组相比,克隆形成率明显增高[CCN1组(34.4±3.6)%,RFP组(24.5±2.9)%,空白组(29.5±3.5)%](P<0.05),培养5d时CCN1组S期细胞[(37.3±2.3)%]比RFP组[(25.2±1.9)%]和空白组[(26.9±1.3)%]增多(P<0.01),细胞迁移能力明显增强划痕愈合试验在1～5d的愈合宽度/原宽度值与RFP组和空白组相比差异显著(P<0.01)。结论外源性CCN1可促进辐射损伤的成纤维细胞生长和迁移,提示CCN1是放创复合伤修复的促进因素之一。

CYR61/CCN1在肝细胞肝癌中的原位表达及其临床意义

目的:观察Cyr61在肝细胞肝癌中表达的意义.方法:采用免疫组化法和RT-PCR共检测65例肝细胞肝癌中Cyr61蛋白和mRNA表达水平,分析其表达与肝癌的临床病理学特征的关系.结果:高分化HCC组织的Cyr61蛋白表达水平高于低分化HCC组织(P<0.01);镜下存在静脉浸润、多结节的HCC组织中Cyr61蛋白表达高于无静脉浸润、单结节的HCC组织(P<0.05).30例肝癌组织Cyr61mRNA表达均为阳性,86.67%(26/30)癌组织Cyr61mRNA表达低于相应癌旁组织(P<0.05).结论:Cyr61可能在肝癌的发生早期发挥重要作用,并与肝癌进程中的间质重建和侵袭转移有关.

基质信号蛋白CCN1心血管作用研究进展

基质信号蛋白CCN1由381个氨基酸残基构成的4个独立结构模块,富含38个保守半胱氨酸,在心血管系统具有广泛的生物学活性,影响血管内皮细胞、平滑肌细胞以及心肌细胞的分化、增殖和迁移;在血管生成、血管损伤修复、心脏发育、心肌梗死等多种病理生理过程中起重要作用。

低氧对小鼠成骨细胞Cyr61/CCN1表达的影响

目的探讨低氧环境对小鼠成骨细胞富含半胱氨酸61(Cyr61/CCN1)表达的影响。方法分别在氧浓度和去铁敏诱导的低氧环境下培养小鼠成骨细胞,Real-time PCR和Western blotting于不同时间点检测成骨细胞低氧诱导因子-1α(HIF-1α)、Cyr61/CCN1和血管内皮生长因子的表达。分别敲除小鼠成骨细胞中HIF-1α和VHL基因,检测细胞Cyr61/CCN1的表达。结果两种低氧环境下,小鼠成骨细胞HIF-1α通路被激活,Cyr61/CCN1 mRNA和蛋白表达均显著增加(P<0.05或P<0.01)。HIF-1α基因敲除小鼠成骨细胞Cyr61/CCN1 mRNA和蛋白表达均显著减少,VHL基因敲除成骨细胞Cyr61/CCN1 mRNA和蛋白表达均显著增加(P<0.05或P<0.01)。结论低氧环境通过激活HIF-1α通路来上调小鼠成骨细胞Cyr61/CCN1的表达。

基质蛋白CCN1与肺部疾病的研究进展

富半胱氨酸蛋白61（cysteine-richangiogenicinducer61，Cyr61/CCN1）是即刻早期基因（earlygrowthresponsegene,Egr)编码的富含半胱氨酸的分泌型基质蛋白，属于CCN家族成员之一。CCN家族包括CCN1、结缔组织生长因子、肾母细胞瘤过度表达基因、Wnt诱导分泌蛋白(Wnt-inducedsecretedprotein,WISP)-1、WISP-2和WISP-36个成员。其中CCN1广泛表达于肺脏不同类型细胞和胞外基质，参与细胞生长、分化、凋亡、黏附和迁移等多种生理功能的调控［1］。Pais等［2］利用转录组分析C57BL/6J鼠和胰岛素样生长因子1(insulinlikegrowthfactor1,IGF1)基因敲除鼠,发现CCN1基因与肺发育成熟中的气道膈改造和远端上皮成熟相关，是IGF1/IGF1R轴在参与胚胎肺成熟发育中的调控基因。在正常生理情况下，CCN1参与肺泡的成熟和胞外基质的生成；在不同肺部疾病中，肺脏不同类型细胞CCN1发生异常表达和差异调控。本文检索了近年来基质蛋白CCN1与肺部疾病中的肺损伤、慢性阻塞性肺病（chronicobstructivepulmonarydisease,COPD)和肺癌相关性的文献报道，就CCN1在不同肺部疾病中的研究进展作一综述，以期望为肺部疾病的预防治疗寻找潜在的分子标记物和治疗靶点。

基质细胞蛋白CCN1/CYR61在骨再生中的作用

CCN1/CYR61(cellular communication network factor 1/cysteine-rich protein 61)是CCN家族成员,是一种重要的分泌基质蛋白。它在胚胎发育过程中对心血管的发育起着至关重要的作用;同时,在生物体成年期,其对炎症反应、血管生成、损伤修复、骨形成及过度纤维化和肿瘤等相关生理、病理过程起着关键作用。本文对CCN1/CYR61在骨再生中的作用作了简要总结,包括其对骨髓间充质干细胞、软骨细胞、成骨细胞及破骨细胞等骨再生相关细胞的调控,以及骨生成过程中必不可少的炎症反应和血管生成等生物学过程。

Cyr61/CCN1在创面愈合中的研究进展

Cyr61/CCN1(cysteine-rich 61)是近年来国内外生物医学领域研究的热点之一。Cyr61通过αvβ3/αvβ5诱导形成p130^(Cas)/CrkII信号复合物,使得FAK磷酸化,进一步激活Rac1信号通路,促进中性粒细胞的胞葬作用,从而降低创面炎症反应,加速愈合。修复期则与整合素α6β1相结合诱导成纤维细胞衰老或激活p16 INK4a/pRb信号通路进一步令抗纤维化因子表达,从而抑制创面纤维化的发生。其在愈创炎症期和组织修复期都扮演重要角色,潜在治疗价值在于加速创面炎症阶段并抑制修复阶段的纤维化,减少瘢痕组织生成。更深入地了解Cyr61与皮肤创面愈合之间的作用关系对研制安全有效的临床治疗方案与药物具有重要意义。

CYR61/CCN1的信号传导病理学研究进展

CCN1由381个氨基酸残基构成的4个独立结构模块,富含38个保守半胱氨酸的基质信号蛋白,近年来发现该信号蛋白在炎症反应、损伤修复、血管生成、肿瘤等多种病理生理过程中起重要作用,在各种疾病中成为研究热点。本文就其生物学特性和在疾病中的信号转导进行了综述。