CCR 5结构与功能研究进展

ＨＩＶ 的侵入与宿主细胞表面共受体ＣＣＲ５ 密切相关。本文报道了ＣＣＲ５ ５端非编码区多态性的研究，以及用基因删除，点突变等方法研究ＣＣＲ５ Ｎ 端和Ｃ端的功能区域。发现了ＣＣＲ５ Δ３２ 受体基因缺陷型能有保护人群免受ＨＩＶ 的感染。

槲皮素通过抑制MIP-1α/CCR1/CCR5信号通路减轻大鼠带状疱疹后神经痛的机制

目的 探讨槲皮素(Que)对大鼠带状疱疹后神经痛(PHN)及趋化因子配体3(CCL3,即MIP-1α)/C-C趋化因子受体(CCR)1/CCR5信号通路的影响。方法 将60只大鼠分为对照组(Con组)、PHN组、L-Que组(30 mg/kg)、M-Que组(60 mg/kg)、H-Que组(120 mg/kg)以及H-Que+MIP-1α组(120 mg/kg Que+0.4μg/kg重组MIP-1α)。检测各组大鼠机械痛阈值(PWT)、热痛阈值(TWL);试剂盒检测外周组织液腺苷、腺嘌呤核糖核苷酸(AMP)、腺苷二磷酸(ADP)以及脊髓背角样本肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和白细胞介素-1β(IL-1β)水平;通过HE染色观察脊髓背角病理切片;免疫荧光染色检测脊髓背角小胶质细胞活化情况;Western blot检测MIP-1α/CCR1/CCR5信号通路蛋白表达。结果 PHN组脊髓背角组织出现破裂现象,神经束排列混乱,炎性细胞浸润、水肿,神经元轻微萎缩现象。与Con组相比,PHN组PWT值、腺苷、AMP、ADP水平降低(P<0.05),TWL值、TNF-α、IL-1β水平、Iba1阳性小胶质细胞数量以及MIP-1α、CCR1、CCR5蛋白水平均升高(P<0.05);Que治疗后,大鼠神经束排列杂乱现象有所改善,炎性细胞浸润减少,神经元萎缩现象减轻;与PHN组相比,L-Que组、M-Que组、H-Que组的PWT值、腺苷、AMP、ADP水平升高(P<0.05),TWL值、TNF-α、IL-1β水平、Iba1阳性小胶质细胞数量以及MIP-1α、CCR1、CCR5蛋白水平均降低(P<0.05),且Que作用效果呈剂量依赖性;与H-Que组相比,H-Que+MIP-1α组的PWT值、腺苷、AMP、ADP水平降低(P<0.05),TWL值、TNF-α、IL-1β水平、Iba1阳性小胶质细胞数量以及MIP-1α、CCR1、CCR5蛋白水平均升高(P<0.05)。结论 Que可能通过抑制MIP-1α/CCR1/CCR5信号通路减轻大鼠炎症反应,进而减轻PHN。

姜黄素调控转录因子FOXP3影响HIV-1感染辅助受体CCR5的作用机制研究

目的:探讨姜黄素通过调控转录因子FOXP3影响HIV-1感染辅助受体CCR5的作用机制。方法:利用生物信息学方法预测并分析转录因子FOXP3与CCR5启动子的结合位点;采用AutoDock 4.2软件对姜黄素与FOXP3进行柔性对接;MTT法检测姜黄素对Jurkat细胞活性的影响;qRT-PCR和Western blot检测不同浓度姜黄素作用于Jurkat细胞后CCR5和FOXP3 mRNA和蛋白表达水平;构建pcDNA3.1-FOXP3真核表达载体;结合转录因子预测结果,运用Overlap PCR法扩增突变型CCR5基因片段,构建突变型CCR5启动子报告载体pFireRluc-Mt-CCR5;利用双荧光素酶报告基因技术验证转录因子FOXP3与CCR5的启动子结合位点。结果:JASPAR转录因子预测结果显示,CCR5启动子区与转录因子FOXP3存在结合位点;分子对接结果显示,姜黄素能够与FOXP3的酶活区域结合;MTT结果显示,姜黄素作用24 h后对Jurkat细胞活性产生抑制作用,IC50为34.48μmol/L;qRT-PCR和Western bot结果显示,不同浓度姜黄素作用于Jurkat细胞后,CCR5和FOXP3 mRNA和蛋白表达水平均降低,且存在剂量依赖性;双荧光素酶报告基因技术证实FOXP3能够与CCR5启动子结合,且转录因子FOXP3可调控CCR5启动子活性;过表达FOXP3后,姜黄素对CCR5的作用结果显示:当姜黄素浓度为60μmol/L时,作用于共转染pcDNA3.1-FOXP3和pFireRluc-Wt-CCR5的HEK293T细胞CCR5启动子荧光素酶活性相对值明显高于pFireRluc-Wt-CCR5+curcumin-60组(P<0.01)。结论:FOXP3能够调控CCR5启动子活性,其作用机制可能是姜黄素通过作用于FOXP3与CCR5启动子结合位点影响CCR5启动子活性。

天麻素通过CCR5/JAK1/STAT1信号通路抑制缺血缺氧新生小鼠小胶质细胞介导的炎症反应

目的:探究天麻素(GAS)通过C-C趋化因子受体5(CCR5)对新生小鼠缺血缺氧性脑损伤(HIBD)后小胶质细胞JAK1/STAT1信号通路及其介导的炎症反应的影响。方法:选择新出生10 d的C57BL/6J小鼠48只,随机分为假手术(sham)组、HIBD模型组和HIBD与GAS联合处理(HIBD+GAS)组;体外培养BV-2小胶质细胞,分为对照(Con)组、氧糖剥夺(OGD)组、OGD+GAS组、GAS组、Maraviroc(MVC)组、OGD+MVC组和OGD+MVC+GAS组。通过RT-qPCR检测CCL4和CCR5的mRNA表达变化,Western blot检测CCR5、p-JAK1、p-STAT1、肿瘤坏死因子α(TNF-α)和白细胞介素1β(IL-1β)蛋白的表达变化,免疫荧光双标染色检测CCR5、p-JAK1和p-STAT1的表达变化。结果:(1)与sham组相比,HIBD组小鼠缺血侧胼胝体区CCL4和CCR5的mRNA水平,以及CCR5、p-JAK1和p-STAT1的蛋白水平明显增高(P<0.05),而HIBD+GAS组中CCL4和CCR5 mRNA水平,以及CCR5、p-JAK1和p-STAT1的蛋白水平显著低于HIBD组(P<0.05)。(2)与Con组相比,OGD组BV-2细胞中CCR5、p-JAK1和p-STAT1蛋白水平明显增高(P<0.05),而OGD+GAS组BV-2细胞中CCR5、p-JAK1和p-STAT1蛋白水平显著低于OGD组(P<0.05)。(3)CCR5拮抗剂MVC在0~80μmol/L范围内不会导致显著的BV-2细胞死亡。与OGD组相比,MVC+OGD组p-JAK1、p-STAT1、TNF-α和IL-1β蛋白水平显著降低(P<0.05),而MVC+OGD组与OGD+MVC+GAS组无明显差异。结论:GAS可通过靶向CCR5抑制小胶质细胞p-JAK1/p-STAT1通路及相关炎症因子的表达,发挥神经保护作用。

天麻素通过调节CCR5/AKT信号传导缓解新生小鼠缺血缺氧后小胶质细胞介导的炎症反应

目的研究天麻素(GAS)通过CCR5/AKT信号对新生小鼠缺血缺氧(HIBD)后小胶质细胞介导炎症反应的影响。方法选用36只10 d龄的C57BL/6J小鼠,随机分为假手术组(Sham)、缺血缺氧模型组(HIBD)、缺血缺氧+天麻素治疗组(HIBD+GAS),12只/组。模型组和治疗组均行左颈总动脉分离并结扎,1 h后置于缺氧环境中40 min后放回母笼,治疗组在术前1 h、缺氧后2 h及缺氧后12 h腹腔注射剂量为100 mg/kg的GAS。体外培养BV2小胶质细胞验证天麻素对CCR5/AKT及炎症因子TNF-α、IL-1β的影响,将其分为:对照组(Control)、氧糖剥夺组(OGD)、OGD+GAS处理组(OGD+GAS)、GAS处理组(GAS);为进一步验证CCR5拮抗剂Maraviroc(M)的作用以及其与GAS联合干预的作用,将细胞分为:Control组、(OGD)组、M组、OGD+M组、OGD+M+GAS组。Control组用高糖培养基正常培养,含GAS组用GAS 0.34μmol/L处理1 h,含M组用Maraviroc 10μmol/L处理1 h,最后将含OGD组均更换为无糖培养基并置于缺氧小室2 h以构建OGD模型。通过Western blotting检测CCR5、AKT、p-AKT、TNF-α、IL-1β的蛋白表达,免疫荧光双标染色检测新生小鼠胼胝体CCR5以及BV2小胶质细胞中CCR5和p-AKT的表达变化。结果与Sham组相比,HIBD组中CCR5、TNF-α表达显著增加,p-AKT表达显著减低(P<0.05,0.01或0.001),GAS治疗后逆转了上述结果(P<0.05或0.01)。与Sham组相比,HIBD组中新生小鼠胼胝体区小胶质细胞标记物IBA1及CCR5的荧光强度明显升高,其共表达增加,而GAS干预后IBA1及CCR5的荧光强度显著降低,共表达减少。与Control组相比,OGD组CCR5、TNF-α、IL-1β表达显著增加,p-AKT表达显著减少(P<0.05,0.01或0.001);GAS或Maraviroc治疗后,逆转了上述结果(P<0.05或0.01)。OGD+M组与OGD+M+GAS组比较,差异无统计学意义。结论GAS可能通过靶向CCR5激活AKT的磷酸化表达水平,抑制炎症因子的表达,发挥神经保护作用。

支气管哮喘患者血清CCR5、eotaxin水平变化及其对免疫Th17、Treg细胞平衡的影响

目的观察支气管哮喘患者血清细胞趋化因子受体5(cell chemokine receptor 5,CCR5)、嗜酸性粒细胞趋化因子eotaxin水平变化,并分析其对免疫Th17、Treg细胞平衡的影响。方法选取我院2019年5月至2020年4月收治的120例支气管哮喘患者作为研究对象。根据疾病严重程度分为轻中度支气管哮喘组(n=72)、重度支气管哮喘组(n=48),选取50例健康人群作为对照组。采用ELISA法检测血清中CCR5、eotaxin含量,并通过流式细胞术测定患者外周血Th17/Treg等T细胞亚群分布。同时检测血清中白介素-17(interleukin-17,IL-17)白介素-6(interleukin-6,IL-6)水平及肺功能用力肺活量(forced vital capacity,FVC)、第1秒用力呼气量(forced expiratory volume in 1s,FEV1)及FEV1/FVC比值(FEV1/FVC%)。Pearson相关性分析评估CCR5、eotaxin水平与Th17/Treg比值的关系。结果重度及轻中度哮喘组患者血清CCR5、eotaxin、IL-6及IL-17含量均明显高于对照组,且重度哮喘组患者高于轻中度组,两两比较差异均有统计学意义(P<0.05)。重度及轻中度哮喘组患者外周血Th17细胞、Treg细胞百分比及Th17/Treg比值均显著高于对照组,而Treg细胞百分比较对照组明显降低,差异均有统计学意义(P<0.05);但重度哮喘组上述指标和轻中度哮喘组患者差异无统计学意义(P>0.05)。重度及轻中度哮喘患者肺功能水平均显著低于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。Pearson相关性分析结果显示,哮喘患者CCR5及eotaxin水平与Th17细胞百分比及Th17/Treg比值呈明显正相关性,而与Treg细胞百分比呈显著负相关性。结论随着哮喘严重程度增加,患者肺功能下降,且CCR5水平及eotaxin水平增加,促进Th17细胞百分比增加,Treg细胞百分比下降,Th17/Treg比值失衡,免疫功能紊乱,哮喘病情加重。

新疆维吾尔族人群HIV协同受体CCR5基因突变的检测

采集新疆维吾尔族血样 316份 ,提取基因组DNA。PCR扩增包含CCR5Δ32和CCR5m30 3突变位点的DNA片段 ,前者直接电泳 ,后者用HinCII酶切后电泳 ,进行基因分型。从中发现CCR5Δ32杂合子 2 2例 ,无突变纯合子 ,无CCR5m30 3突变。CCR5Δ32群体分布符合Hardy Weinberg平衡 ,性别之间无差异。新疆维吾尔族人CCR5Δ32频率为 3.48% ,高于中国汉族人但低于欧洲高加索人 ,与印度和巴基斯坦少数民族接近 ,在地域分布上具有连续性。由于CCR5Δ32突变杂合体可延缓AIDS发病进程 ,这一发现对于维吾尔族人的AIDS防治具有积极意义。

趋化因子受体CCR3、CCR5和CXCR3与自然流产的相关性

目的探讨外周血、脾脏、胸腺趋化因子受体CCR3、CCR5、CXCR3与自然流产的关系。方法用双标记流式细胞分析技术检测自然流产模型组小鼠(CBA/J×DBA/2,n=14)、正常妊娠模型组小鼠(CBA/J×BALB/c,n=13)和正常非孕组小鼠(CBA/J,n=11)外周血、脾脏以及胸腺中CD4+T细胞CCR3、CCR5和CXCR3这三类趋化因子受体的表达。结果自然流产模型组外周血CD4+T细胞CCR3的表达率低于正常妊娠模型组(P<0.01),CCR5和CXCR3高于正常妊娠模型组(P<0.05,P<0.01);但三个指标与正常非孕组相比,差异均无统计学意义(P>0.05)。自然流产模型组脾脏CD4+T细胞CCR3的表达率低于正常妊娠模型组(P<0.01),高于正常非孕组(P<0.05);而CCR5和CXCR3高于正常妊娠模型组(P<0.05),但与正常非孕组相比,差异无统计学意义(P>0.05)。自然流产模型组胸腺CD4+T细胞CCR3的表达率低于正常妊娠模型组(P<0.05),高于正常非孕组(P<0.01);而CXCR3的表达率高于正常妊娠模型组(P<0.05),但与正常非孕组相比,差异无统计学意义(P>0.05);CCR5与其他两组相比,差异无统计学意义(P>0.05)。结论CD4+T细胞上CCR3、CCR5和CXCR3的表达异常可能在自然流产的发病中起作用。

CCR5和CD30在自身免疫性甲状腺疾病外周淋巴细胞上的表达

目的:探讨自身免疫性甲状腺疾病(AITD)中辅助性T淋巴细胞(Th1/Th2)的平衡偏移及其在发病中的作用。方法:选择21例初发Graves病(GD组),21例桥本甲状腺炎(HT组)和45名健康人(对照组)为研究对象,应用流式细胞仪技术检测外周血淋巴细胞中CD4+CCR5+和CD4+CD30+细胞,以其各自百分比和平均荧光强度(MFI)作为反映Th1/Th2免疫应答强度的指标。结果:与对照组相比,GD组CD4+CD30+细胞升高(P<0.05),而CCR5+细胞MFI明显减低(P<0.01);HT组CD4+CCR5+和CD4+CD30+细胞均升高(P<0.05)。GD组中CD30+细胞MFI与TRAb浓度正相关,与FT3、FT4、TSH均无相关性。结论:GD的发生可能与Th2优势应答密切相关;Th1和Th2细胞可能共同参与了HT的发病。

趋化因子受体CCR5的研究进展

CCR5为趋化因子CC受体家族成员,属7次跨膜G蛋白耦联受体,配体为CCL3(MIP-1α)、CCL4(MIP-1β)、CCL5(RANTES)。CCR5主要表达于单核/巨噬细胞和淋巴细胞,与其配体介导CCR5+免疫细胞的趋化、募集过程。因此,多种免疫性疾病的发生和发展过程均有CCR5参与。CCR5是人类免疫缺陷病毒1型(HIV-1)入侵时的重要辅助受体,而在肿瘤细胞和各类肿瘤相关间质细胞的表面也可见其表达,并介导肿瘤增殖、浸润等多种生物学过程。随着相关研究技术的发展,进一步加深了对CCR5的结构、功能、信号通路及其在相关疾病中的作用的认识。

中国人CCR5732基因突变的检测及其对HIV遗传易感性的初步评估

为了解ＣＣＲ５Δ３２ 基因突变在中国本土人群基因组中的分布，初步评估我国人群对ＨＩＶ－１ 感染的遗传易感性，用ＰＣＲ扩增、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ 杂交和ＤＮＡ 测序等分子生物学方法对９１５ 名中国人来源的基因组ＤＮＡ中ＣＣＲ５Δ３２ 基因突变进行了检测。结果发现，所有被检测的个体绝大多数均表现为ＣＣＲ５ ｗ ｔ／ｗ ｔ纯合子等位基因型，仅检测到两例个体为突变的杂合子ＣＣＲ５ｗ ｔ／Δ３２ 基因型，而未见到有突变的ＣＣＲ５Δ３２／Δ３２ 纯合子的个体。上述初步结果提示：在我国人群中，ＣＣＲ５Δ３２ 基因突变率很低（约为０．２％ ），所以我国绝大多数人群对ＮＳＩ嗜巨噬细胞的ＨＩＶ－１

应用TALEN技术对兔CCR5基因进行靶向修饰

缺少合适的能够被人免疫缺陷病毒1型（Human immunodeficiency virus 1,HIV-1）感染的动物模型是获得性免疫缺陷综合征/艾滋病（Acquired immunedeficiency syndrome,AIDS）疫苗和药物研发的瓶颈.HIV-1能在野生型兔子中形成持续感染,在共表达人CD4和CCR5的兔细胞系中,HIV-1能高效复制,并形成合胞体.若在家兔中高表达人CD4和CCR5,就可能获得研究AIDS的理想动物模型.文章采用高效基因打靶技术—类转录激活因子效应物核酸酶（Transcription activator-like effector nuclease,TALEN）,探讨在家兔CCR5基因位点定点敲入人CD4和CCR5,获得能够感染HIV-1家兔模型的可能性.针对家兔CCR5基因,设计了两对TALENs和一个同源打靶载体,TALEN mRNAs和DNA同源片段显微注射到家兔受精卵中,体外培养3～5 d后,收集24枚胚胎,对胚胎的基因突变情况进行PCR和测序分析.结果显示,在家兔CCR5位点,24枚胚胎均发生了基因敲除,5枚胚胎还发生了人CD4和CCR5基因敲入.该结果为建立艾滋病研究新动物模型奠定了基础.

趋化因子受体CCR5亲合短肽的筛选

趋化因子受体5(CCR5)是HIV-1与宿主细胞结合的辅助因子之一,其功能缺失或被CCR5拮抗剂封闭则会阻止HIV-1感染细胞.为得到与CCR5特异结合的肽类拮抗剂,采用噬菌体展示技术,以稳定表达CCR5的CHO细胞(CHO/CCR5)作为靶标,通过噬菌体随机12肽库筛选与CCR5特异结合的多肽;经过四轮筛选后,挑选20个阳性噬菌体克隆进行测序,从中得到11个含有AFDWTFVPSLIL序列的小分子肽.含该序列的噬菌体能与抗人CCR5单抗(2D7)竞争性结合CCR5,且合成肽AFDWTFVPSLIL对趋化因子RANTES与CHO/CCR5的结合具有明显的抑制作用,初步证明该小肽与CCR5具有特异性结合作用.

CCR5在炎症性肠病患者肠黏膜的表达及其与β-arrestin2表达的关系

目的:通过分析CCR5在炎症性肠病(IBD)患者活检肠黏膜的表达及其与β-arrestin 2表达的相关性,探讨CCR5与β-arrestin 2在IBD发病中的作用。方法:IBD活动期组53例、IBD缓解期组26例和正常对照组30例纳入研究,用En Vision二步免疫组化方法检测活检肠黏膜CCR5和β-arrestin 2的表达。结果:IBD活动期组CCR5阳性表达率及免疫组化评分均高于正常对照组和IBD缓解期组(P<0.05),CCR5表达与IBD活动期组的临床严重程度、病变范围及内镜下分级无明显关联性;β-arrestin 2在IBD活动期组的阳性表达率均明显低于IBD缓解期组和正常对照组(P<0.05),并且在IBD活动期β-arrestin 2表达与CCR5表达呈负相关性(P<0.05)。结论:在IBD活动期组肠黏膜CCR5呈高表达,β-arrestin 2呈明显低表达,CCR5与β-arrestin 2表达呈负相关性。

中国人群CCR5△32、CCR2-64I、SDF1-3’A基因多态性与HIV-1感染相关性的Meta分析

目的探讨中国人群CCR5△32、CCR2-64I、SDF1-3'A三种基因的多态性与HIV-1感染之间的关系。方法检索国内外有关中国人群CCR5△32、CCR2-64I、SDF1-3'A基因多态性与HIV感染相关性的病例对照研究文献并进行Meta分析。结果符合CCR5△32的研究共14个,累计HIV感染者病例1607例,正常对照组1632例。杂合子(wt/mt)、纯合子(mt/mt)和杂合子加纯合子(wt/mt+mt/mt)与野生基因型(wt/wt)相比合并的OR值(95%CI)分别为1.156(0.808,1.654)、0.997(0.198,5.022)、1.149(0.808,1.634)。符合CCR2-64I的研究共12个,累计HIV感染者病例1415例,正常对照组1239例。杂合子(wt/mt)、纯合子(mt/mt)和杂合子加纯合子(wt/mt+mt/mt)与野生基因型(wt/wt)相比合并的OR值(95%CI)分别为1.005(0.844,1.197)、1.191(0.808,1.754)、1.028(0.870,1.214)。符合SDFl-3'A的研究10个,累计HIV感染者病例1179例,正常对照组1003例。杂合子(wt/mt)、纯合子(mt/wt)和纯合子加杂合子(wt/mt+mt/mt)与野生基因型(wt/wt)相比合并的OR值(95%CI)分别为1.010(0.830,1.228)、1.188(0.860,1.643)、1.038(0.861,1.250)。结论中国人群CCR5△32、CCR2-64I、SDFl-3'A三种抗性基因与HIV-1感染之间无相关性,显示CCR5△32、CCR2-641、SDFl-3'A三种基因对中国人群HIV-1感染可能不具有保护作用,提示中国人群可能为易感人群。

乙型肝炎、性病和HIV-1感染人群中CCR5,CCR2和SDF1等位基因多态性的研究

目的:研究乙型肝炎、HIV-1感染者和性病患者中CCR5,CCR2和SDF1等位基因的分布及其特点。 方法:收集乙型肝炎患者(268例)、艾滋病感染者(130例)和性病(259例)的血液标本共657份,应用QIAGEN全血细胞基因组提取试剂盒,分离纯化人血细胞基因组DNA样品,应用PCR或PCR-RFLP分析CCR5,CCR2-64I和SDF1-3’A等位基因突变频率和分布特点。 结果:在乙型肝炎、性病和HIV-1感染者人群中,CCR5△32的突变频率分别为0.19％、0％和0％,在259例个体性病患者中只有一例男性发生了杂合子突变,而在乙型肝炎和HIV-1感染者人群中没有检测出CCR5△32突变基因,可见,CCR5△32的突变率较低,反之,CCR2-64I的突变频率较高,与前述三种患者对应的突变频率分别为19.3％、19.6％和20.7％,进而分析发现SDF1-3’A等位基因在乙肝、性病和HIV-1感染人群中的突变率分别为27.8％,27.4％和26.9％,应用x^2检测与统计学分析显示在乙肝,性病和HIV-1感染人群中CCR2-64I和SDF1-3’A等位基因突变分布之间无连锁关系。 结论:突变频率很低的CCR5△32基因型在上述3种类型传染病的发病过程中可能不起主要作用;而突变频率较高的CCR2-64I和SDF1-3’A基因型的功能及其在上述3种传染病进程中的意义有待进一步研究。

广西壮族人群HIV协同受体CCR5基因突变的检测

目的了解广西壮族人群中HIV协同受体CCR5△32等位基因突变频率和多态性的特点,为评估广西壮族人群对HIV的遗传易感性和艾滋病的防治提供理论依据。方法以152例壮族大学生为研究对象,应用PCR和DNA直接测序等方法检测CCR5及CCR5△32突变体。结果未发现CCR5△32等位基因。结论由于未发现CCR5△32,推测广西壮族人群对HIV-1病毒感染可能具有较大的遗传易感性。

趋化因子RANTES及其受体CCR5与炎性疾病

趋化因子（Chemokines）是一类对不同靶细胞具有趋化效应的蛋白质家族,分子量多为8-12 k D,由机体多种细胞（尤其是活化免疫细胞）分泌,主要依赖与特异性受体的结合而发挥生物学作用,在细胞生长、分化、黏附及定向迁移等方面起重要作用。