婴儿双歧杆菌介导的CD和UPRT联合5-FC基因疗法对黑色素瘤的体外治疗实验研究

目的采用婴儿双歧杆菌为载体,探讨尿嘧啶磷酸核糖转移酶基因(UPRT)对胞嘧啶脱氨酶/5-氟胞嘧啶(CD/5-FC)自杀基因系统抗瘤作用的增强效应。方法构建原核表达质粒pGEX-UPRT,以电穿孔法将该质粒转化入婴儿双歧杆菌,筛选阳性重组菌并鉴定。采用M TT法检测表达的U PRT是否可以与CD产生抗瘤协同作用,并观察细胞形态学改变。结果重组婴儿双歧杆菌可以正确表达UPRT。体外M TT检测显示CD+UPRT组细胞存活率低于对照组(P<0.01),且可使B 16-F 10鼠黑色素瘤细胞对5-FC的杀伤敏感性(IC50=0.015μm o l/mL)提高,是CD组(IC50=0.127μm o l/mL)的8.5倍。形态学观察CD+UPRT组肿瘤细胞显示出明显的损伤性改变,细胞生长受到明显抑制,而UPRT组和CD组变化明显不如前者。结论婴儿双歧杆菌联合转导UPRT基因可明显增强CD/5-FC自杀基因系统对鼠黑色素瘤细胞B 16-F 10的杀伤作用。

5-FC/CD∷UPRT联合基因对大鼠脑胶质瘤的治疗作用

目的探讨5-氟胞嘧啶(5-FC)/CD∷UPRT联合基因系统对大鼠脑胶质瘤的治疗作用。方法以逆转录病毒介导构建C6-CD∷UPRT细胞系,应用立体定向技术移植C6-CD∷UPRT细胞至SD大鼠尾状核,设立C6-pLXSN和C6细胞为对照组,建立脑胶质瘤荷瘤鼠模型,应用5-FC腹腔注射治疗,观察肿瘤大小、大鼠存活期、电镜观察细胞形态和流式细胞术检测肿瘤细胞的凋亡指标的变化。结果5-FC/CD∷UPRT治疗组(A组)与各对照组相比,A组肿瘤直径平均为(4.2±0.7)mm,远小于对照组的(8.3±1.3)mm,(P<0.01);对照组平均存活期(32±3)d,A组为(85±2)d(P<0.01);A组电镜显示核染色质分裂明显,并见典型的凋亡小体;A组肿瘤细胞中凋亡细胞所占百分率为19.36%。结论5-FC/CD∷UPRT联合基因对大鼠脑胶质瘤有显著的治疗效果。

婴儿双歧杆菌介导的CD/UPRT双自杀基因系统对黑色素瘤细胞的杀伤作用

目的探讨尿嘧啶磷酸核糖转移酶基因(UPRT)对胞嘧啶脱氨酶/5-氟胞嘧啶(CD/5-FC)自杀基因系统抗瘤作用的增强效应。方法构建重组质粒pGEX-UPRT,以电穿孔法转化婴儿双歧杆菌,筛选出阳性克隆菌,加入5-FC厌氧条件下培养24h后取其上清,加到B16-F10细胞培养液中,采用MTT法检测细胞生存率,并观察细胞形态学改变。结果阳性克隆菌可正确表达UPRT基因。与对照组比较,CD组、UPRT组及CD/UPRT组细胞存活率均明显下降;与CD组及UPRT组比较,CD/UPRT组细胞存活率明显降低。且CD/UPRT组肿瘤细胞显示出明显的损伤性改变,而CD组、UPRT组变化不如前者。结论婴儿双歧杆菌介导的UPRT基因可明显增强CD/5-FC系统对鼠黑色素瘤细胞B16-F10的杀伤作用。

肿瘤厌氧靶向双自杀基因治疗系统pTRKH2-PsT/CD、pTRKH2-PsT/UPRT的构建

目的利用婴儿双歧杆菌对实体瘤低氧区的靶向效应,构建肿瘤厌氧靶向双自杀基因治疗系统pTRKH2-PsT/CD和pTRKH2-PsT/UPRT。方法用PCR的方法从质粒pGEX/CD和pGEX/UP-RT中扩增出CD基因和UPRT基因,双酶切CD基因、UPRT基因和质粒pTRKH2-PsT,分别连接后重组于大肠杆菌中。之后用电转化的方法将重组质粒转入婴儿双歧杆菌中。用RT-PCR检测该系统mR-NA水平的表达,SDS-PAGE检测该系统在蛋白质水平的表达。在黑色素瘤B16-F10细胞上检测该系统的体外肿瘤细胞杀伤效果。结果成功地将CD基因和UPRT基因转入了质粒pTRKH2-PsT,CD基因和UPRT基因的测序结果表明序列与Genebank公布的序列一致。RT-PCR检测到CD和UPRTmRNA水平的明显表达。在含有CD基因的婴儿双歧杆菌细胞全蛋白中发现了CD蛋白质的表达,在含有UPRT基因的婴儿双歧杆菌上清液中发现了UPRT蛋白质的表达。黑色素瘤细胞的低存活率证明了pTRKH2-PsT/CD、pTRKH2-PsT/UPRT自杀基因治疗系统对黑色素瘤的显著杀伤作用。结论肿瘤厌氧靶向双自杀基因治疗系统pTRKH2-PsT/CD、pTRKH2-PsT/UPRT构建成功并显示出杀伤肿瘤细胞的作用。

超声微泡联合pDsRed2-N1-CD/UPRT融合自杀基因对肺癌细胞的杀伤作用

目的:探讨超声微泡联合pDsRed2-N1-CD/UPRT融合自杀基因在肺癌A549细胞中的表达水平及其杀伤作用。方法:提取前期构建的pDsRed2-N1-CD/UPRT质粒,转染肺癌A549细胞,分为A组:空白对照组;B组:脂质体+质粒;C组:超声照射+脂质体+质粒;D组:超声照射+微泡+脂质体+质粒。荧光显微镜下观察质粒的转染情况,免疫细胞化学法及Western blot法检测胞嘧啶脱氨酶(Cytosine deaminase,CD)、尿嘧啶磷酸核糖转移酶(Uracil phosphoribosyltransferase,UPRT)在各组细胞中的蛋白表达水平,MTT法检测超声微泡联合CD/UPRT质粒对肺癌A549细胞的生长抑制作用。结果:超声微泡能提高A549细胞中CD/UPRT质粒转染率达(54.8±2.59)%。免疫细胞化学与Western blot结果均显示联合超声微泡后CD、UPRT蛋白表达明显增加(P<0.05)。在前体药物5-氟尿嘧啶(5-Fluorouracil,5-FU)作用下,CD/UPRT质粒转染对细胞有一定的杀伤作用,联合超声微泡后,细胞的生长抑制率明显升高(P<0.05)。结论:超声微泡能提高CD/UPRT质粒在肺癌A549细胞中的转染率及CD、UPRT在细胞中的蛋白表达,从而增强CD/UPRT对肺癌A549细胞的杀伤作用。

肿瘤厌氧靶向双自杀基因治疗系统pH2/CD,pH2/UPRT的构建

目的利用婴儿双歧杆菌对实体瘤低氧区的靶向效应,构建肿瘤厌氧靶向双自杀基因治疗系统pH2/CD和pH2/UPRT。方法用PCR的方法从质粒pGEX/CD和pGEX/UPRT中扩增出CD基因和UPRT基因,用内切酶BamHI和SalI酶切CD基因,UPRT基因和质粒pH2,分别连接后重组于大肠杆菌中。用电转化的方法将重组质粒转入婴儿双歧杆菌中。通过双酶切和基因测序的方法检验质粒pH2/CD和pH2/UPRT的正确性,RT-PCR检测该系统的mRNA表达。在黑色素瘤B16-F10细胞上检测该系统的体外肿瘤细胞杀伤效果。结果成功地将CD基因和UPRT基因转入了乳酸菌表达质粒pH2,在纯化后的质粒被双酶切后,CD基因被分割为6.9kb和1.3kb的两部分,UPRT基因被分割为6.9kb和620bp的两部分。CD基因和UPRT基因的测序结果表明序列与Genebank公布的序列一致。RT-PCR检测到CD和UPRTmRNA的明显表达。黑色素瘤细胞的低存活率证明pH2/CD,pH2/UPRT自杀基因治疗系统对黑色素瘤的强大杀伤作用。结论肿瘤厌氧靶向双自杀基因治疗系统pH2/CD,pH2/UPRT构建成功并显示出强大的杀伤肿瘤细胞的作用。

真菌源性CD::UPRT联合基因治疗脑胶质瘤的实验研究

目的 研究5-FC／CD：：UPRT联合基因治疗策略对胶质瘤细胞C6的杀伤效应。方法 扩增yCD：：UPRT融合基因并构建含yCD：：UPRT基因的重组表达载体；载体转染包装细胞PT67，所获重组病毒转染胶质瘤细胞C6，筛选并鉴定阳性转基因克隆；用MTT法检测不同浓度5-FC对CD：：UPRT转基因细胞的杀伤效应。结果 PCR法扩增出全长CD：：UPRT基因，经测序证实序列正确，重组逆转录病毒表达载体pLXSN—yCD：：UPRT经双酶切获目的条带，载体转染包装细胞获重组逆转录病毒（滴度达3．5×10^6CFU／m1）并转染C6，经筛选获得转基因阳性克隆C6-yCD：：UPRT细胞株，检测显示该细胞株有效表达目的基因。当5-FC终浓度≥10p,mol／L时，实验组与对照组的细胞增殖力出现显著差异（P〈0．01），5-FC作用96h后电镜观察到凋亡小体。结论 5-FC／yCD：：UPRT联合基因治疗策略对胶质瘤细胞C6有明显的杀伤作用。

超声微泡联合pDsRed2-N1-CD/UPRT融合自杀基因治疗肺癌的机制

目的研究超声微泡联合pDsRed2-N1-CD/UPRT融合自杀基因治疗肺癌的机制。方法采用PCR法扩增大肠杆菌CD和UPRT基因,克隆入pDsRed2-N1载体,构建pDsRed2-N1-CD/UPRT质粒,转化感受态大肠杆菌BL21(DE3),挑取阳性菌,提取质粒,酶切及测序鉴定。将质粒与超声微泡融合,将混合物转染A549细胞,测定CD/UPRT基因的直接杀伤效应和旁效应;并检测不同强度的超声对超声微泡与质粒混合物中质粒结构、转染细胞形态及转染效率的影响。结果 pDsRed2-N1-CD/UPRT质粒经酶切及测序证明构建正确。荧光显微镜下可观察到质粒在超声微泡中的分布。转染A549细胞后,随着5-FU浓度的增加,细胞生长抑制率也增加,可高达58%;在相同剂量的5-FU作用下,增加转染细胞的比例,相应的细胞生长抑制率也随之增加,可高达78%。低能量的超声波对pDsRed2-N1-CD/UPRT质粒结构无明显改变,电泳条带变化不大,对转染细胞形态也无明显影响,超声介导基因转染率最高可达30%。结论超声微泡能增强CD/UPRT基因对肿瘤细胞的直接杀伤和旁效应,起到治疗肿瘤的作用;低能量的超声微泡能提高CD/UPRT基因对细胞的转染效率,且不会损伤细胞及目的基因的DNA。

建立稳定表达融合自杀基因CD/UPRT.UL49的CNE-2鼻咽癌细胞株

目的:建立稳定表达融合自杀基因CD/UPRT.UL49的CNE-2鼻咽癌细胞株。方法:构建表达载体pcDNA3.1(-)E6.BARF1p.CD/UPRT.UL49,经脂质体法转染CNE-2细胞,G418和前体药物5-氟胞嘧啶筛选出阳性克隆细胞并扩大培养。抽提阳性克隆细胞总蛋白质,Western-blotting检测目的基因表达。结果:融合自杀基因CD/UPRT.UL49在CNE-2转染细胞内稳定表达。结论:本组通过脂质体转染技术,成功地建立了稳定表达融合CD/UPRT.UL49基因的CNE-2细胞株。