CD158分子表达在他克莫司、霉酚酸酯联合甲基强的松龙治疗顽固性慢性移植物抗宿主病中的追踪观察

目的 :探讨慢性移植物抗宿主病 (graft-versus-hostdisease,GVHD)症状期及缓解期CD15 8分子的表达变化。方法 :观察异基因造血干细胞移植后发生广泛性慢性GVHD的儿童患者 ,应用他克莫司 (FK5 0 6 ) ,霉酚酸酯(MMF)和甲基强的松龙 (MP)联合治疗的毒副作用和疗效 ;同时采用流式细胞仪检测外周血中CD15 8在NK细胞和T细胞的表达 ,比较治疗前后CD15 8的表达。结果 :移植前、慢性GVHD症状期和治疗后CD4 + CD15 8a+ 和CD4 +CD15 8b+ 表达水平极其低下 ,但无明显差异。 5例急性GVHD患者CD3+ CD15 8b+ 和CD3+ CD8+ CD15 8b+ 的表达水平分别为 4 . 97%± 2 . 36 %和 4 . 5 8%± 2 90 % ,与移植前相比差异显著 (P <0 . 0 5 ) ,CD3-CD16 + CD15 8b+ 的表达也明显高于移植前 (P <0 . 0 5 )。 6例慢性GVHD患者症状期 ,CD3+ CD15 8b+ 和CD3+ CD8+ CD15 8b+ 的表达均高于移植前的水平(P <0 . 0 5 ) ;在缓解期 ,CD3+ CD15 8b+ 、CD3+ CD8+ CD15 8b+ 和CD3-CD16 + CD15 8b+ 的表达水平逐渐下降 ,与慢性GVHD症状期相比差异显著 (P <0 . 0 5 ) ,与移植前无明显差异。移植后 6 - 12个月CD3-CD16 + CD15 8b+ 表达水平与移植前无明显差异。结论 :CD15 8b分子在T细胞表达水平增加与慢性GVHD的发生有关 ,FK5 0 6 ,MMF和MP联合有?

阻断KIR2DL4(CD158d)增强NK细胞的杀伤功能

目的利用抗体阻断人原代培养的自然杀伤(NK)细胞表面的杀伤细胞免疫球蛋白样受体2DL4(KIR2DL4),抑制其与配体人白细胞抗原G(HLA-G)的结合,观察对NK细胞杀伤功能的影响。方法用免疫磁珠法分离人NK细胞并培养,流式细胞术检测所得NK细胞的纯度;流式细胞术检测NK细胞表面KIR2DL4的表达水平和人乳腺癌SK-BR-3细胞表面HLA-G的表达水平;将NK细胞与SK-BR-3细胞共培养,并加入KIR2DL4的阻断抗体,ELISA检测NK细胞分泌γ干扰素(IFN-γ)的水平,利用流式细胞术检测NK细胞表面CD107a的表达水平,以检测其脱颗粒情况。结果分离得到的人原代NK细胞纯度可达90%以上;共培养实验发现,KIR2DL4的阻断抗体可促进NK细胞分泌IFN-γ,且NK细胞表面CD107a的表达水平也明显提高,提示其脱颗粒能力增强。结论阻断KIR2DL4信号可明显促进NK细胞的杀伤功能,KIR2DL4在NK细胞杀伤靶细胞的过程中发挥抑制性作用。

Th1、Th2样细胞因子对CD158^+细胞比率的调节作用

目的:观察Th1、Th2样细胞因子对外周血CD158+细胞比率的调节作用,为寻找干细胞移植免疫耐受的方法提供论理依据。方法:将Th1样细胞因子(IL-2、IFN-γ)和Th2样细胞因子(IL-4、IL-6),单独或联合与人外周血单个核细胞(PBMC)培养72h,用流式细胞法分析总CD158a+、CD158b+细胞及CD3+、CD4+、CD8+和CD16+ CD56+细胞亚群中CD158a+、CD158b+细胞的比率。结果:①细胞因子对CD3+、CD4+、CD8+细胞及CD16+ CD56+细胞的影响:IL-2和IFN-γ均可增加上述细胞的百分率(P<0.05),但IL-2的作用大于IFN-γ(P<0.05)。IL-2+IFN-γ联合处理的效应高于IFN-γ单独处理(P<0.05)。IL-4+IL-6可降低上述细胞的百分率(P<0.05)。IL-2+IL-4对上述细胞百分率的影响,高于IL-4(P<0.05)但低于IL-2(P<0.05)。②细胞因子对CD158a+/b+细胞的影响:IL-2可增加总的CD158a+/b+细胞及CD3+、CD4+、CD8+和CD16+ CD56+细胞中的CD158a+/b+细胞的百分比率(P<0.05);IL-2+IFN-γ可增加CD158a+/b+细胞的百分率(P<0.05),但与IL-2单独处理无明显区别,IL-4+IL-6可降低CD158a+/b+细胞的百分率(P<0.05)。IL-2+IL-4可增加总的CD158a+/b+细胞及各亚群中CD158a+/b+细胞的百分率(P<0.05),但低于IL-2单独处理(P<0.05)。结论:IL-2有促进CD158基因表达或使CD158a+、CD158b+?

CD158受体表位封闭对急性髓系白血病患者NK细胞杀伤活性的影响

目的研究急性髓系白血病患者NK细胞CD158受体表位封闭对自身白血病细胞杀伤活性的影响。方法分离急性髓系白血病患者及健康志愿者外周血NK细胞,以自身白血病细胞及K562细胞为靶细胞,用CCK-8试剂盒检测CD158a、CD158b单克隆抗体封闭前后NK细胞在1:1、5:1、10:1效靶比下对靶细胞的杀伤活性。结果患者与正常人NK细胞对K562细胞均有高度杀伤活性,且随效靶比增大而增高(P<0.01)。效靶比为1:1、5:1、10:1时,患者NK细胞在封闭前对白血病细胞杀伤活性分别为(1.5±0.3)%、(5.6±0.8)%、(11.8±0.6)%,封闭后分别为(21.8±0.7)%、(38.6±0.9)%、(53.9±1.4)%,各效靶比组封闭前后差异有统计学意义(P<0.01)。结论急性髓系白血病患者NK细胞CD158受体表位封闭可提高NK细胞对自身白血病细胞的体外杀伤能力。

SiRNA沉默NK细胞CD158b表达及对异体树突状细胞的杀伤作用

目的探讨特异性的SiRNA干扰人NK细胞CD158b基因表达对异体树突状细胞杀伤的影响。方法将特异性的CD158b-SiRNA导入人NK细胞后,qRT-PCR及流式检测NK细胞CD158b基因mRNA及其蛋白质的表达。LDH释放法检测RNA干扰NK细胞CD158b前后对异体DC细胞杀伤效果的影响。结果特异性siRNA片段能有效降低CD158b mRNA水平,最大干扰效率达72%;脂质体及阴性对照siRNA片段对NK细胞CD158b的表达无特异的干扰作用;流式细胞仪检测证明转染特异SiRNA-CD158b后CD158b蛋白表达明显下降。RNA干扰NK细胞CD158b的表达后能显著提高其杀伤异体DC的活性。结论特异性的CD158b-SiRNA可有效降低NK细胞中CD158b mRNA水平,明显下调CD158b蛋白表达。RNA干扰NK细胞CD158b后所产生的异源反应性NK细胞对异体DC细胞杀伤效果显著增加,证明通过人工改变NK细胞KIR基因的表达产生KIR-HLA错配的异反应性NK细胞有望应用于异基因骨髓移植中降低GVHD。

不明原因早期复发性自然流产患者蜕膜组织CD158受体的表达

目的探讨不明原因早期复发性自然流产(RSA)患者和正常对照组早孕子宫蜕膜组织中杀伤细胞免疫球蛋白样受体(KIR)CD158表达的特征。方法选择2009年1月至2010年6月就诊的RSA患者和同期计划生育门诊因计划外孕行人工流产术者各30例,并根据孕周分组,流式细胞术检测蜕膜组织细胞表面标记,比较RSA患者和对照者CD56、CD16、CD158a(KIR2DL1/S1)、CD158b(KIR2DL2/S2)表达的变化规律。结果①RSA患者CD56+细胞数显著少于对照者(P=0.007),CD56+/CD16-细胞较对照组降低(P<0.05);②RSA患者CD158a在CD56+/CD16-细胞表面的表达显著降低(P=0.026);③按孕周分组分析显示,孕7～10周患者CD56+/CD16-细胞表面表达CD158a较同期对照者显著降低(P=0.010);④正常早孕蜕膜组织CD158a、CD158b与CD56表达呈显著正相关(P<0.01)。结论早孕蜕膜组织CD56+/CD16-细胞减少可能为不明原因自然流产的发病机制之一。CD56+/CD16-细胞表面CD158a表达下降与不明原因自然流产有关,且其变化与早孕孕周相关。

伴颈动脉粥样硬化脑梗患者CD4＋CD28null T细胞CD158j表达和ERK磷酸化水平的关系

目的 探讨伴颈动脉粥样硬化（CA）脑梗患者CD4＋CD28null T细胞上CD158j的表达百分率和ERK磷酸化（p-ERK）水平的关系及对颈动脉粥样斑块不稳定的影响.方法 采用流式细胞术检测106例伴CA脑梗、33例颈动脉正常脑梗患者和50例健康人外周血CD4＋CD28null T细胞数量,以及CD4＋CD28null T细胞CD158j和穿孔素（perforin）的表达,36例斑块不稳定患者CD4＋T细胞p-ERK水平.ELISA法检测血清IFN-γ水平.B超检查以上人群颈动脉血管内壁粥样硬化情况.结果 脑梗患者CD4＋CD28nullT细胞数量、CD4＋CD28null T细胞CD158j和perforin的表达,以及血清IFN-γ水平,均明显高于健康对照组（P均〈0.01）;CD4＋CD28null T细胞数量、CD4＋CD28null T细胞CD158j和perforin的表达,以及血清IFN-γ水平,在脑梗患者中由高到低依次为颈动脉不稳定斑块组、颈动脉稳定斑块组、颈动脉内-中膜厚度（IMT）增厚组和颈动脉正常组.颈动脉不稳定斑块脑梗患者CD4＋CD28null T细胞CD158j的表达与p-ERK水平呈显著性正相关（P〈0.01）.结论 伴CA脑梗患者CD4＋CD28null T细胞数量明显增多.CD158j可能通过上调p-ERK水平,促进CD4＋CD28null淋巴细胞增殖,产生细胞毒效应和分泌细胞因子,最终导致颈动脉粥样斑块不稳定.

封闭CD158受体表位对供者自然杀伤细胞杀伤受者成熟树突细胞的研究

自然杀伤（natural killer，NK）细胞是固有免疫系统的一部分，是机体抵御病毒感染、肿瘤细胞生长及转移的第一道防线。而NK细胞的异源反应性更是目前研究的热点。临床上，HLA不相合造血干细胞移植（HSCT）中，“licensed”NK细胞具有异源反应性。

免疫球蛋白样抑制性受体KIR基因与HLA-Cw的匹配对NK细胞活性的影响

本研究探索自然杀伤(natural killer,NK)细胞表面杀伤细胞免疫球蛋白样抑制性受体(killer immunoglob-ulin-like inhibition receptor,KIR)基因与HLA-Cw配体匹配对NK细胞活性的影响。对27名健康人取新鲜外周血20ml,用NK细胞免疫磁珠分选试剂盒负向分选高纯度NK细胞。对30例初治确诊急性髓系白血病(AML)患者取新鲜骨髓液10ml,分离单个核细胞作为靶细胞。流式细胞仪检测NK细胞CD158a,CD158b表达水平。取健康人和患者的外周血各2ml,以PROTRANS法抽提DNA,采用序列特异性引物PCR-SSP分型技术分别检测HLA-Cw、KIR基因。MTT法检测KIR与HLA-Cw基因不同组合的NK细胞对AML患者白血病细胞的杀伤率。结果表明:分选后的NK细胞,纯度为(90.8±6.08)%。NK细胞KIR基因与靶细胞HLA-Cw等位基因的匹配数少则NK细胞的杀伤效应强,0个等位基因匹配的杀伤率为(50.66±8.40)%,1个匹配与2个匹配的杀伤率分别为(38.28±6.71)%,(19.74±4.15)%,(F=20.226,p<0.001)。NK细胞的KIR表达水平与杀伤作用也有一定的联系(F=16.276,p值<0.001)。结论:NK细胞对AML白血病细胞的杀伤作用与抑制性KIR/HLA-Cw的匹配数及KIR的表达相关,匹配越少、KIR表达越低,杀伤率越高。

经抗CDl58单克隆抗体修饰的供者自然杀伤细胞对受者树突状细胞的杀伤作用

目的研究应用抗CDl58a和CDl58b单克隆抗体封闭供者杀伤细胞免疫球蛋白样受体（KIR）的抑制性受体KIR2DLl及KIR2DL3后，供者自然杀伤细胞（NK细胞）对受者树突状细胞（DC）的杀伤作用，及其减少移植物抗宿主病（GVHD）的作用。方法对15例异基因全相合造血干细胞移植的供、受者进行HLA及KIR高分辨基因分析，采集供者骨髓及受者外周血单个核细胞，培养受者DC作为靶细胞，使用磁珠负选高纯度供者NK细胞作为效应细胞，用抗CDl58a和CDl58b单抗封闭供者KIR抑制性受体，并采用四甲基偶氮唑盐比色法分别检测抑制性KIR封闭前后NK细胞对靶细胞的杀伤作用。结果在效靶比为10：1下，供者NK细胞抑制性受体经抗体封闭后，对受者13C的杀伤活性明显提高，随着封闭抗体浓度的增加而增高，各浓度间比较，差异均有统计学意义（P〈（）．05）。当供、受者KIR配体匹配模式为宿主抗移植物（HVG）模式时，供者NK细胞对受者成熟DC的杀伤效果明显高于供、受者KIR基因全相合或移植物抗宿主（GVH）模式，在用不同浓度单抗封闭KIR抗体后，随着封闭抗体浓度的增加，杀伤效果增高更明显（．P〈0．05）。结论利用抗CDl58单抗封闭KIR可以提高供者来源NK细胞对受者DC的杀伤活性，输注异源反应性NK细胞可能作为一种新的治疗GVHD的方法。