抗CD3/CD20双特异性抗体生物学活性测定方法的建立

目的建立基于报告基因的抗CD3/CD20双特异性抗体生物学活性检测方法。方法以WIL2-S细胞系作为靶细胞,以Jurkat-NF-κB-Luc转基因细胞系作为效应细胞,对抗体的量效范围、孵育时间、诱导时间、效靶比及细胞接种密度进行优化,构建可用于测定抗CD3/CD20双特异性抗体生物学活性的报告基因法。依据ICHQ2的指导原则对方法进行全面验证,包括专属性、准确性、精密度、线性、稳定性。结果成功建立了具有量效关系的抗CD3/CD20双特异性抗体生物学活性检测方法,该方法的抗体起始浓度为500 ng/mL,稀释倍数为1∶4,共计8个浓度点(500,125,31.25,7.81,1.95,0.49,0.12,0.031 ng/mL),效靶比为4∶1,诱导时间为4 h。本方法具有良好的专属性;5个不同稀释组回收率样品经测定,相对效价分别为59.63%±4.57%,75.54%±4.05%,99.98%±9.63%,123.90%±5.54%和142.51%±12.82%;对应的回收率分别为93.17%±7.15%,94.42%±5.06%,99.98%±9.63%,99.12%±4.43%以及91.21%±8.21%,CV分别为7.67%,5.35%,9.63%,4.47%和9.00%,上述结果的变异系数CV值均<10%;实测效价与理论效价线性回归分析相关系数R^(2)=0.9823,线性良好;本研究建立的方法可以敏感检测出抗体结构变化对生物活性的影响,对双特异性抗体的稳定性检测有一定的指导意义。结论利用转基因细胞法成功建立了抗CD3/CD20双特异性抗体生物学活性检测方法,该方法专属性强、准确性高、重复性好,可用于评价抗CD3/CD20双特异性抗体生物学活性。

韦氏环伴滤泡辅助T细胞表型并异常表达CD20的外周T细胞淋巴瘤1例并文献复习

目的探讨韦氏环伴滤泡辅助T细胞表型的外周T细胞淋巴瘤(Waldeyer’s ring peripheral T-cell lymphoma with T-follicular helper phenotype,wPTCL-TFH)临床病理学、遗传学特征及预后。方法收集1例wPTCL-TFH临床资料,对其病变组织行HE、免疫组化染色、EBER原位杂交及TCR基因重排检测,应用一代测序法检测IDH2 Exon4基因突变情况,并复习相关文献。结果患者女性,61岁,临床表现为咽痛、消瘦,无其他发热、盗汗等B症状。组织学表现为扁桃体实质内小-中等大淋巴细胞弥漫浸润。免疫表型:肿瘤细胞表达全T细胞标志物及滤泡辅助T细胞标志物:CD10、BCL6和PD-1,弥漫表达CD20,部分表达CD30(约10%);TCR基因单克隆性重排,IDH2基因未见突变。采用R-CHOP方案化疗6个周期,随访7个月,患者无瘤生存。结论wPTCL-TFH异常表达CD20者临床罕见,化疗中加入利妥昔单抗可能对CD20异常表达wPTCL-TFH有效,仍需更多的病例进一步证实。

异常表达CD20的结外NK/T细胞淋巴瘤病理特点分析并文献复习

目的探索异常表达CD20的结外NK/T细胞淋巴瘤的病理形态特点、诊断要点及鉴别诊断。方法分析3例异常表达CD20的结外NK/T细胞淋巴瘤,结合病理形态特点、免疫表型及与其他形态学特点和免疫表型类似的淋巴瘤的鉴别诊断,并进行文献复习。结果异常表达CD20的结外NK/T细胞淋巴瘤形态学特点与普通型结外NK/T细胞淋巴瘤类似,免疫表型表现为部分T细胞标记阳性、CD56、细胞毒标记物、EBER ISH阳性、CD20弱-中等阳性,其余B细胞标记物CD79a、PAX-5均为阴性。其中2例肿瘤细胞阳性表达CD8。结论异常表达CD20的结外NK/T细胞淋巴瘤是一种罕见免疫表型的NK细胞源性淋巴瘤,需要综合分析抗体表达情况及和其他淋巴瘤进行鉴别诊断,免疫组织化学染色阳性模式以及多抗体联合应用对于明确诊断有重要作用。

注射抗CD20单克隆抗体后发生荨麻疹性血管炎一例

患者,女,61岁。全身皮肤泛发红斑1天。起病前7天因“红斑型天疱疮”应用抗CD20单克隆抗体治疗。用药后躯干、四肢泛发水肿性红斑。结合组织病理诊断为荨麻疹性血管炎。给予甲泼尼龙、氯雷他定等治疗,4天后患者皮疹逐渐消退,原有红斑部位可见色素沉着斑。随访8个月,皮疹未复发。

原发纵隔CD20阴性弥漫大B细胞淋巴瘤1例并文献复习

回顾性分析1例原发纵隔CD20阴性弥漫大B细胞淋巴瘤病例的临床资料,并复习相关文献。患者,男,26岁反复胸痛3个月,影像学检查提示纵隔巨大占位,于外科行纵隔占位活检,术后免疫组织化学提示:CD20(-)、CD19(+)、PAX-5(+)、CD3(-)、CD5(-)、CD10(-)、TdT(-)、MUM1(+)、CD30(个别+)、Ki-67(约60%+)、BCL-2(+)、C-MYC(10%~20%)。诊断为CD20阴性弥漫大B细胞淋巴瘤,予以多疗程联合化疗后,疗效欠佳,病情进展,失访。CD20阴性弥漫大B细胞淋巴瘤侵袭性强,诊治难度大,预后差。

表达CD20的孤立性浆细胞瘤伴轻度骨髓浸润1例

伴t(11;14)的浆细胞肿瘤常同时表达CD20,而该类患者肿瘤细胞形态常表现为小成熟浆细胞,易与B细胞淋巴瘤混淆。本例患者以孤立性髓外占位为首发表现,组织活检病理免疫组化示CD20、CD79a阳性,病理会诊首先考虑为B细胞淋巴瘤,但经复习多次肿物活检及骨髓病理结果,结合免疫分型、基因重排及免疫固定电泳等结果,最终确诊为孤立性髓外浆细胞瘤伴轻度骨髓浸润,经局部放疗联合VRD(硼替佐米、来那度胺、地塞米松)方案4疗程后肿块明显缩小,考虑治疗有效。

利妥昔单抗用于初诊CD20阳性B-ALL患儿的效果及预后分析

目的观察利妥昔单抗辅助CCLG-ALL2008方案治疗初诊CD20阳性B系急性淋巴细胞白血病(B-ALL)患儿的疗效,探讨影响患儿预后的相关因素,并建立预后风险系数模型。方法收集2018年5月至2020年5月在该院初诊CD20阳性B-ALL的168例患儿的临床资料进行回顾性分析。根据治疗方法不同分为对照组(84例,采用CCLG-ALL2008方案治疗)和观察组(84例,采用利妥昔单抗联合CCLG-ALL2008方案治疗)。比较两组治疗效果和治疗期间不良反应的发生情况,分析影响观察组患儿预后的相关因素,并建立风险系数模型。结果观察组患儿近期疗效显著优于对照组(P<0.05),两组患儿治疗期间不良反应发生情况比较,差异无统计学意义(P>0.05)。Cox回归模型分析显示T315I突变、FLT3突变、微小残留病灶(MRD)阳性及MLL/AF4阳性是观察组患儿预后的独立影响因素(P<0.05)。风险系数模型=0.287×X_(T315I突变)+0.940×X_(FLT3突变)+0.954×X_(MRD阳性)+1.416×X_(MLL/AF4阳性)。受试者工作特征(ROC)曲线分析结果显示该风险系数模型判断预后的AUC为0.840(95%CI:0.696~0.985,P<0.001),灵敏度为0.846,特异度为0.746。结论利妥昔单抗联合CCLG-ALL2008方案治疗初诊CD20阳性B-ALL患儿效果显著,其预后可能与T315I突变、FLT3突变、MRD阳性及MLL/AF4阳性相关,临床据此建立的风险系数模型对预后判断具有较高的准确性。

CD20阳性的蕈样肉芽肿伴大细胞转化一例

CD20是B细胞的特异性抗体,也是与T细胞淋巴瘤鉴别诊断的最重要的一种抗体,近年有多例CD20阳性的T细胞淋巴瘤报道。MF发生大细胞转化可发生于全病程,但多以肿瘤期常见,大细胞转化常是预后不良的标志。本文报道一例CD20阳性的蕈样肉芽肿伴大细胞转化的病例。

CD20+胃肠道惰性T细胞淋巴增殖性疾病1例

患者女性,40岁,因反复腹泻9年,加重1周入院。实验室检查:白细胞、淋巴细胞、血小板、C-反应蛋白升高;大便及尿潜血阳性。腹部CT示:直肠中下段肠壁稍增厚,腹股沟超声示:双侧腹股沟见数个实质低回声结节,边界清楚,无融合。直乙肠镜示:回盲部、升结肠、横结肠、降结肠、乙状结肠、直肠黏膜水肿明显,可见散在黏膜糜烂、溃疡,局部肠腔内黏膜呈结节样外观。

CD20阳性T细胞淋巴瘤的临床病理学特征及相关机制——2例患者临床报告

目的 探讨白细胞分化抗原20(cluster of differentiation 20,CD20)阳性T细胞淋巴瘤(T cell lymphoma,TCL)的临床病理学特征及相关发生机制。方法 筛选宝鸡市中心医院确诊的2例CD20阳性的TCL病例并回顾相关文献,分析该病的临床病理学特点;利用生物信息学及基因组学方法探讨其潜在的发生机制。结果 两例患者均为男性,年龄为39岁、82岁;病例1为胃肠道惰性T细胞淋巴组织增殖性疾病(gastrointestinal indolent T-cell lymphoproliferative disorder,ITLPD-GI),病例2为皮肤亲毛囊性蕈样肉芽肿(folliculotropic mycosis fungoides,FMF)(肿瘤期)。免疫组化结果显示,T细胞标志物CD3强阳性、CD4或CD8阳性、B细胞标志物CD20阳性、CD79α及PAX-5阴性。T细胞受体重排均呈单克隆性,发生机制可能与SIGLEC15和MS4A1基因在TCL的DNA复制过程中发生基因移位融合,导致二者在T淋巴细胞内高表达,从而促进CD20在TCL中异常表达。两例患者均未接受利妥昔单抗治疗,随访至今均带瘤生存。结论 CD20阳性TCL较为少见,易误诊为B细胞淋巴瘤(B cell lymphoma,BCL)。诊断应结合临床表现、病理组织学形态、免疫组织化学技术、基因分子检测技术等多种诊疗手段;探究CD20阳性TCL的潜在发生机制,将为后续临床治疗提供帮助。

CD20单抗联合苯达莫司汀治疗惰性淋巴瘤的疗效及安全性

目的探讨CD20单抗联合苯达莫司汀治疗惰性淋巴瘤的疗效及安全性。方法根据治疗方式的不同将90例惰性淋巴瘤患者分为对照组(n=44)和观察组(n=46),对照组患者给予化疗,观察组患者在对照组的基础上给予苯达莫司汀联合CD20单抗治疗。比较两组患者临床疗效、免疫功能指标(CD3^(+)、CD4^(+)、CD8^(+))及不良反应发生情况。结果观察组患者的疾病控制率为82.61%,高于对照组患者的61.36%,差异有统计学意义(P﹤0.05)。治疗后,两组患者CD3^(+)、CD4^(+)水平均高于本组治疗前,CD8^(+)水平均低于本组治疗前,且观察组患者CD3^(+)、CD4^(+)水平均高于对照组,CD8^(+)水平低于对照组,差异均有统计学意义(P﹤0.05)。观察组患者的不良反应总发生率为76.09%,与对照组患者的77.27%比较,差异无统计学意义(P﹥0.05)。结论CD20单抗联合苯达莫司汀治疗惰性淋巴瘤患者的疗效显著,可提高患者的免疫功能,且不会增加不良反应。

CD20阴性原发性中枢神经系统弥漫性大B细胞淋巴瘤1例

原发性CD20阴性弥漫性大B细胞淋巴瘤是一类罕见的淋巴细胞增殖性肿瘤,常起病于胃肠道、口腔、心包腔等人体腔隙,原发于神经系统者较为罕见。由于其具有高侵袭性、结外侵犯倾向、易产生化疗抵抗性等特点,为临床诊治带来很大挑战。扬州大学附属医院收治1例65岁CD20阴性原发性中枢神经系统弥漫性大B细胞淋巴瘤女性患者,常规化疗耐药,经放疗后选用Bruton酪氨酸激酶抑制剂联合PD-1抑制剂治疗,患者病情得到控制,较治疗前明显好转,该患者目前仍在继续规律治疗中。

CD20^+外周T细胞淋巴瘤1例并文献复习

目的观察CD20+外周T细胞淋巴瘤的临床病理学特征、分子遗传学改变并复习文献,以提高对此罕见亚型的诊断及鉴别诊断。方法采用免疫组化EnVision两步法观察1例CD20+外周T细胞淋巴瘤的免疫表型,原位杂交法分析EB病毒感染,应用PCR技术检测IgH、T细胞受体(TCR)基因克隆性重排分析,同时结合文献报道的35例CD20+T细胞淋巴瘤与该病例分析其临床病理学特征和预后。结果本例及文献报道共36例,其中男性24例,女性6例,另6例性别不详,平均年龄58岁,中位年龄67岁,组织学类型为最常见非特指型外周T细胞淋巴瘤(22例)。免疫表型:肿瘤细胞强表达T细胞标记(CD2、CD3、CD5、CD8)及滤泡辅助T细胞标记(CD10、BCL-6、CXCL13、PD1),弱弥漫表达CD20、CD79a,不表达CD4、PAX5。瘤细胞间散在转化的大B免疫母细胞EBER阳性。PCR法检测TCR基因单克隆重排。患者接受R-CHOP治疗。结合文献:获得随访16例,随访时间2~16个月,其中9例死亡,中位生存时间为9个月,死亡与存活病例患者年龄差异无显著性,组织学亚型差异也无显著性。结论 CD20+外周T细胞淋巴瘤是一种罕见外周T细胞淋巴瘤的变异亚型,临床及病理特征可能会与B细胞淋巴瘤混淆,形态学观察、多种抗体的联合使用及TCR基因重排等分子遗传学研究可避免误诊,部分肿瘤免疫表型和血管免疫母细胞性T细胞淋巴瘤相似,提示二者可能是同一肿瘤的不同阶段或两者存在互相演进的关系。

人早期胚中CD20阳性细胞的免疫组织化学定位

目的 探索CD20阳性细胞在人早期胚中的分布及意义。方法 用免疫组织化学SP法对10例6—7周人早期胚内CD20阳性细胞进行定位观察。结果 1．CD20阳性细胞局限于人早期胚肝内；2．在人胚肝内，CD20阳性颗粒主要局限于B细胞的细胞核内，呈不均质的颗粒状分布，细胞质和细胞膜呈阴性反应。结论 在人早期胚内，CD20定位于肝内的B细胞，并分布在细胞核内；该研究结果为深入探讨CD20阳性细胞的功能和作用机制提供了重要线索。

抗CD20单克隆抗体治疗难治性自身免疫性溶血性贫血

本研究初步观察抗CD20单克隆抗体利妥昔(rituximab)用于治疗难治性自身免疫性溶血性贫血(AIHA)的疗效和安全性。对1例用糖皮质激素、脾切除治疗无效的AIHA患者,采用利妥昔单克隆抗体,375mg/m2,每周1次,共4次,观察溶血症状的改变并监测血红蛋白(Hb)水平及其它检验指标,同时观察有无不良反应发生。结果表明,首次治疗后11天乳酸脱氢酶(LDH)、总胆红素(TBIL)、直接胆红素(IBIL)逐渐下降,第45天降至正常范围;首剂治疗25天后Hb水平比治疗之前升高到95-100g/L以上。治疗后已4月余,患者仍处于缓解状态。治疗过程中未发生明显不良反应。结论:抗CD20单克隆抗体利妥昔用于治疗难治性自身免疫性溶血性贫血是有效而且安全的。

人4-1BBL胞外区/抗CD20融合蛋白的构建和表达

目的:构建和表达人4-1BBL胞外区/抗CD20双功能融合蛋白,并测定该融合蛋白的生物学活性。方法:采用PCR和ovelap PCR方法构建人4-1BBL胞外区/抗CD20双功能融合蛋白,并用双脱氧终止法测定DNA序列;采用亲和层析法纯化该产物,并用150g/L SDS-PAGE和Western blot鉴定纯化产物;采用FACS法鉴定纯化产物与靶细胞的结合活性。结果:DNA序列测定结果表明:人4-1BBL胞外区/抗CD20双功能融合蛋白已构建成功,表达可溶性产物的产量达4mg/L以上,具有与Raji细胞(CD20+)和A549(4-1BB+)细胞结合的活性。结论:利用融合蛋白形式,首次成功地构建了人4-1BBL胞外区/抗CD20融合蛋白,并获得较高表达。表达产物具有与相应2个靶抗原结合的活性。

CD20在经典型霍奇金淋巴瘤HRS细胞中的表达及其与预后的关系

背景与目的:B淋巴细胞标记CD20在经典型霍奇金淋巴瘤(classical Hodgkin's lymphoma,CHL)HRS(Hodgkin and Reed-Sternberg)细胞的表达率为5%～58%,CD20表达对预测CHL预后的意义仍有争议。本研究旨在了解CD20在中国CHLHRS细胞中的表达情况及其与预后的关系。方法:收集1995年1月到2004年12月在中山大学肿瘤医院存档的70例初治CHL石蜡标本,HE染色和免疫组化法行CD20、CD15和CD30染色。以高于10%的HRS细胞胞膜表达CD20作为阳性标准。单因素分析采用log-rank检验,采用Cox部分风险模型进行多因素分析。结果:21例(30.0%)CHLHRS细胞CD20阳性,年龄≥45岁的CHL患者CD20的阳性率(53.3%)显著高于年龄<45岁患者(23.6%)(P=0.026)。26例CHL(37.1%)患者CD15阳性,70例CHL均为CD30阳性。全组中位随访时间58.3个月,CD20(+)组和CD20(-)组CHL5年无失败生存率分别为76.2%和77.6%(P=0.484);5年总生存率分别为80.4%和92.5%(P=0.006)。多因素分析显示,年龄和分期为CHL无失败生存和总生存的独立预后因素。结论:CD20在CHLHRS细胞的阳性率为30%,年龄≥45岁CHL患者HRS细胞CD20阳性率显著高于年龄<45岁患者,但未能证实CD20是初治CHL无失败生存和总生存期的独立预后因素。

抗CD20单克隆抗体在儿童原发性难治性肾病综合征的应用新进展

原发性难治性肾病综合征(idiopathic refractory nephritic syndrome,IRNS)一直是临床治疗的棘手问题。抗CD20单克隆抗体是一种诱导B细胞溶解和凋亡的新型免疫抑制剂,其出现极大地改善了IRNS患者的预后。近年来,多数病例分析和临床试验对抗CD20单克隆抗体治疗儿童IRNS的有效性进行了报道。本文就抗CD20单克隆抗体的作用机制、在IRNS的临床应用、不良反应及研究中存在的问题进行综述。

干扰素γ与抗CD20单克隆抗体对骨髓瘤细胞增殖影响的体外研究

目的 :体外研究干扰素γ能否增加多发性骨髓瘤 (MM)瘤细胞表面CD2 0的表达、增强抗CD2 0单克隆抗体美罗华抗骨髓瘤的作用。方法 :将浓度为 (0～ 80 0 )U ml的重组人干扰素γ(hrγ IFN) ,联合浓度为 (0～ 2 0 )U ml的美罗华 ,分别与 14例初治 (初治组 )和 16例复发难治 (难治组 )的MM患者瘤细胞在半固体甲基纤维素培养体系中培养 ,观察它们对瘤细胞集落形成的影响 ,并用流式细胞仪测定上述不同浓度hrγ IFN处理前后瘤细胞表面CD2 0的表达。结果 :hrγ IFN浓度分别≥ 5 0U ml或≥ 10 0U ml可明显增加初治组或难治组瘤细胞表面CD2 0的表达 ;单用≥ 5 0U ml或≥ 10 0U ml的hrγ IFN对初治组或难治组瘤细胞集落形成有抑制作用 ,而单用≥ 16U ml的美罗华只对初治组瘤细胞集落形成有轻度抑制 ;≥ 5 0U ml的hrγ IFN联合≥12U ml的美罗华 ,或≥ 10 0U ml的hrγ IFN联合≥ 16U ml的美罗华 ,对初治组或难治组瘤细胞集落形成的抑制大于单用同浓度的hrγ IFN或美罗华。结论 :体外hrγ IFN能抑制MM瘤细胞集落形成 ,并可通过增加瘤细胞表面CD2 0的表达而增强美罗华对瘤细胞集落形成的抑制作用。

重组融合蛋白抗CD20Fab-LDM的构建、表达及体外活性研究

目的构建和表达抗CD20Fab-LDP(力达霉素辅基蛋白)融合蛋白,制备强化融合蛋白抗CD20Fab-LDM(力达霉素),并测定该融合蛋白的生物学活性。方法采用PCR和overlapPCR方法构建抗CD20Fab-LDP融合蛋白,并用双脱氧终止法测定DNA序列;采用亲和层析法纯化该产物,并用Western blot鉴定纯化产物;采用FACS方法鉴定纯化产物与靶细胞的结合活性;采用冷乙二醇法制备强化融合蛋白抗CD20Fab-LDM;采用MTT法鉴定抗CD20Fab-LDM对CD20+Raji细胞特异性的细胞毒作用。结果DNA序列测定结果表明抗CD20Fab-LDP融合蛋白已构建成功,可溶性表达产物的产量可达4mg.L-1以上,具有与Raji细胞(CD20+)结合的活性,与抗CD20Fab的亲合常数相当,抗CD20Fab-LDM体外能特异性杀伤Raji细胞,IC50值为0.9×10-10mol.L-1。结论成功地构建了抗CD20Fab-LDP融合蛋白,并获得可溶性高效表达,表达产物具有与相应靶抗原结合的活性,并成功制备了抗CD20Fab-LDM强化融合蛋白,体外能特异性杀伤CD20+的Raji细胞。