Objective To design and construct the eukaryotic expression vector which expresses Anti-CD3 ScFv-B7.1 fusion molecules and predict the biological characteristics, the rationality and feasibility of the spacer. Methods...Objective To design and construct the eukaryotic expression vector which expresses Anti-CD3 ScFv-B7.1 fusion molecules and predict the biological characteristics, the rationality and feasibility of the spacer. Methods To analyze the flexibility, Hoop & Woods hydrophilicity and the epitope of Anti-CD3 ScFv-B7.1 fusion molecule at secondary structure level by computer simulation utilizing the GoldKey software. Results By comparing with Anti-CD3 ScFv and B7.1 respectively, it shows that Anti-CD3 ScFv-B7.1 fusion molecules can form correct secondary structure with the linking of the spacer, the fusion does not change the original hydrophilicity and epitopes of both Anti-CD3 ScFv and B7.1, no new epitopes emerge; The spacer is flexible and shows low antigenicity. Conclusion The design of Anti-CD3 ScFv-B7.1 fusion molecule are rational and feasible, the expressed fusion protein could retain the maximum biological activity and the function of both Anti-CD3 ScFv and B7.1.展开更多
目的:分析表达上调TCRζ后慢性粒细胞白血病(CML)患者T细胞基因表达谱的变化特点,探讨转基因上调TCRζ后T细胞活性恢复的分子机制。方法:收集3例初发未治疗慢性期CML患者的外周血单个核细胞(PBMCs),利用MACS法分选获得CD3+T细胞;利用核...目的:分析表达上调TCRζ后慢性粒细胞白血病(CML)患者T细胞基因表达谱的变化特点,探讨转基因上调TCRζ后T细胞活性恢复的分子机制。方法:收集3例初发未治疗慢性期CML患者的外周血单个核细胞(PBMCs),利用MACS法分选获得CD3+T细胞;利用核转染技术转染TCRζ-IRES2-EGFP(实验组)和pIRES2-EGFP(对照组)质粒至T细胞中;应用AffymetrixGeneChip Human Gene 2.0 ST Array芯片对上调TCRζ链表达的CML T细胞和对照细胞基因表达谱进行检测,并对差异表达基因进行GO功能注释分析和KEGG通路的富集分析。结果:共筛选出2 248个差异表达基因,其中553个基因表达上调,1 695个基因表达下调(P <0.05);GO功能注释分析和KEGG通路的富集分析结果显示,参与T细胞免疫功能相关的生物学过程,如TCR信号通路、T细胞增殖和活化等的差异表达基因发生显著富集;TCR信号通路,T细胞增殖、活化和凋亡通路中促进T细胞增殖活化的部分核心基因表达明显上调,而抑制T细胞活化的部分核心基因表达则明显下调。结论:上调TCRζ后CML患者T细胞的活化和增殖能力明显改善,其分子机制可能与促进T细胞活化增殖的相关基因明显上调,抑制T细胞活化和促进细胞凋亡相关基因表达的下调有关。展开更多
目的:建立基于细胞的抗EpCAM+CD3双特异性抗体(bispecific antibody,BsAb)生物学活性报告基因测定方法(reporter gene assay,RGA)。方法:构建稳定表达萤光素酶(luciferase,Luc)的HcT116-Luc细胞为靶细胞,以Hu T78细胞为效应细胞,通过对...目的:建立基于细胞的抗EpCAM+CD3双特异性抗体(bispecific antibody,BsAb)生物学活性报告基因测定方法(reporter gene assay,RGA)。方法:构建稳定表达萤光素酶(luciferase,Luc)的HcT116-Luc细胞为靶细胞,以Hu T78细胞为效应细胞,通过对样品浓度、孵育时间、细胞接种时间、效靶比和细胞接种密度进行优化建立报告基因法,根据人用药品注册技术要求国际协调会(International Conference on Harmonization of Technical Requirements for Registration of Pharmaceuticals for Human Use,ICH)Q2指导原则和《中华人民共和国药典》(2015)指导原则,对RGA法的特异性、准确性、精密度、线性、代次稳定性和耐用性进行验证。结果:建立RGA方法经优化后的检测条件:效靶比为10∶1;细胞接种密度为1.1×10^(4)细胞·孔^(-1);Bs Ab样品以3000 ng·mL^(-1)为起始浓度1∶3.5向下稀释9个浓度梯度(共10个检测浓度);系列稀释样品与细胞孵育时间为72 h。孵育结束后测定Luc强度并以4-参数模式拟合剂量-效应曲线,计算样品相对生物学活性。建立RGA法的特异性、耐用性均符合应用要求。采用50%,70%,80%,100%,120%,130%,150%和200%共8个效价浓度进行准确性、精密度和线性验证,8个效价浓度的生物学活性回收率在95.48%~107.37%,变异系数(coefficient of variation,CV)在4.80%~9.97%,均<10%,实测效价与理论效价线性回归分析相关系数r^(2)>0.99。第14~33代次HcT116-Luc细胞Luc表达情况稳定。结论:基于传代细胞建立的抗EpCAM+CD3 Bs Ab报告基因生物学活性测定方法操作简便,其特异性、精密度、准确性、耐用性方面符合应用要求,可作为此类双特异性抗体活性评价的方法,用于其质量控制中。展开更多
文摘Objective To design and construct the eukaryotic expression vector which expresses Anti-CD3 ScFv-B7.1 fusion molecules and predict the biological characteristics, the rationality and feasibility of the spacer. Methods To analyze the flexibility, Hoop & Woods hydrophilicity and the epitope of Anti-CD3 ScFv-B7.1 fusion molecule at secondary structure level by computer simulation utilizing the GoldKey software. Results By comparing with Anti-CD3 ScFv and B7.1 respectively, it shows that Anti-CD3 ScFv-B7.1 fusion molecules can form correct secondary structure with the linking of the spacer, the fusion does not change the original hydrophilicity and epitopes of both Anti-CD3 ScFv and B7.1, no new epitopes emerge; The spacer is flexible and shows low antigenicity. Conclusion The design of Anti-CD3 ScFv-B7.1 fusion molecule are rational and feasible, the expressed fusion protein could retain the maximum biological activity and the function of both Anti-CD3 ScFv and B7.1.
文摘目的:分析表达上调TCRζ后慢性粒细胞白血病(CML)患者T细胞基因表达谱的变化特点,探讨转基因上调TCRζ后T细胞活性恢复的分子机制。方法:收集3例初发未治疗慢性期CML患者的外周血单个核细胞(PBMCs),利用MACS法分选获得CD3+T细胞;利用核转染技术转染TCRζ-IRES2-EGFP(实验组)和pIRES2-EGFP(对照组)质粒至T细胞中;应用AffymetrixGeneChip Human Gene 2.0 ST Array芯片对上调TCRζ链表达的CML T细胞和对照细胞基因表达谱进行检测,并对差异表达基因进行GO功能注释分析和KEGG通路的富集分析。结果:共筛选出2 248个差异表达基因,其中553个基因表达上调,1 695个基因表达下调(P <0.05);GO功能注释分析和KEGG通路的富集分析结果显示,参与T细胞免疫功能相关的生物学过程,如TCR信号通路、T细胞增殖和活化等的差异表达基因发生显著富集;TCR信号通路,T细胞增殖、活化和凋亡通路中促进T细胞增殖活化的部分核心基因表达明显上调,而抑制T细胞活化的部分核心基因表达则明显下调。结论:上调TCRζ后CML患者T细胞的活化和增殖能力明显改善,其分子机制可能与促进T细胞活化增殖的相关基因明显上调,抑制T细胞活化和促进细胞凋亡相关基因表达的下调有关。
文摘目的:建立基于细胞的抗EpCAM+CD3双特异性抗体(bispecific antibody,BsAb)生物学活性报告基因测定方法(reporter gene assay,RGA)。方法:构建稳定表达萤光素酶(luciferase,Luc)的HcT116-Luc细胞为靶细胞,以Hu T78细胞为效应细胞,通过对样品浓度、孵育时间、细胞接种时间、效靶比和细胞接种密度进行优化建立报告基因法,根据人用药品注册技术要求国际协调会(International Conference on Harmonization of Technical Requirements for Registration of Pharmaceuticals for Human Use,ICH)Q2指导原则和《中华人民共和国药典》(2015)指导原则,对RGA法的特异性、准确性、精密度、线性、代次稳定性和耐用性进行验证。结果:建立RGA方法经优化后的检测条件:效靶比为10∶1;细胞接种密度为1.1×10^(4)细胞·孔^(-1);Bs Ab样品以3000 ng·mL^(-1)为起始浓度1∶3.5向下稀释9个浓度梯度(共10个检测浓度);系列稀释样品与细胞孵育时间为72 h。孵育结束后测定Luc强度并以4-参数模式拟合剂量-效应曲线,计算样品相对生物学活性。建立RGA法的特异性、耐用性均符合应用要求。采用50%,70%,80%,100%,120%,130%,150%和200%共8个效价浓度进行准确性、精密度和线性验证,8个效价浓度的生物学活性回收率在95.48%~107.37%,变异系数(coefficient of variation,CV)在4.80%~9.97%,均<10%,实测效价与理论效价线性回归分析相关系数r^(2)>0.99。第14~33代次HcT116-Luc细胞Luc表达情况稳定。结论:基于传代细胞建立的抗EpCAM+CD3 Bs Ab报告基因生物学活性测定方法操作简便,其特异性、精密度、准确性、耐用性方面符合应用要求,可作为此类双特异性抗体活性评价的方法,用于其质量控制中。
