白细胞介素-38对乳腺癌患者CD8^(+)T淋巴细胞功能的影响

目的探讨白细胞介素-38(IL-38)在乳腺癌患者中的表达及其对CD8^(+)T细胞功能的调控作用。方法纳入2020年7月—2022年9月在新乡医学院第一附属医院就诊的44例乳腺癌患者、25例乳腺良性肿瘤患者和20例对照者。分离所有受试者的血浆和外周血单个核细胞,分离乳腺癌患者肿瘤组织中的肿瘤浸润淋巴细胞,纯化CD8^(+)T细胞。应用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测血浆IL-38蛋白水平,应用实时定量PCR检测组织IL-38 mRNA相对表达量。使用重组人IL-38刺激乳腺癌患者外周血和肿瘤组织分离的CD8^(+)T细胞,建立CD8^(+)T细胞与乳腺癌细胞系MCF-7的共培养系统,通过测定乳酸脱氢酶水平计算靶细胞死亡比例,ELISA法检测培养上清中穿孔素、颗粒酶B、干扰素-γ和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)水平,流式细胞术检测CD8^(+)T细胞的免疫检查点分子表达。结果乳腺癌患者血浆IL-38水平(74.23±19.88 pg/mL)高于乳腺良性肿瘤患者(62.87±16.27 pg/mL,P=0.018)和对照者(61.77±12.75 pg/mL,P=0.013)。乳腺癌患者肿瘤组织中IL-38 mRNA相对表达量显著高于癌旁组织(1.57±0.22 vs.1.00±0.18,P<0.001)。外周血和肿瘤浸润CD8^(+)T细胞诱导靶细胞死亡比例、穿孔素和颗粒酶B分泌在直接接触共培养组中的水平高于间接接触共培养组(P<0.05),但干扰素-γ和TNF-α分泌水平在直接接触共培养组和间接接触共培养组之间的差异无统计学意义(P>0.05)。在直接接触共培养组内,靶细胞死亡比例、穿孔素、颗粒酶B、干扰素-γ、TNF-α在IL-38刺激组中的水平低于无刺激组(P<0.05)。在间接接触共培养组内,靶细胞死亡比例、干扰素-γ、TNF-α在IL-38刺激组中的水平亦低于无刺激组(P<0.05),但穿孔素和颗粒酶B水平在间接接触共培养组内的IL-38刺激组和无刺激组之间的差异无统计学意义(P>0.05)。CD8^(+)T细胞中免疫检查点分子表达水平在无刺激组和IL-38刺激组之间的差异均无统计学意义(P>0.05)。结论乳腺癌患者中高表达的IL-38可能参与诱导CD8^(+)T细胞功能衰竭。

CD4^(+)CD8^(-)T细胞大颗粒淋巴细胞白血病的临床分析

目的:探讨CD4^(+)CD8^(-)T细胞大颗粒淋巴细胞白血病(T-LGLL)患者的临床特征及诊疗方案。方法:报告1例CD4^(+)CD8^(-)T-LGLL患者的临床表现、诊断及治疗情况,并结合文献进行回顾性分析。结果:患者为老年女性(70岁),临床进展缓慢,以血小板减少为主要表现,骨髓增生较低下,血涂片以大颗粒淋巴细胞为主,免疫分型及T细胞克隆重排符合T-LGLL应用环磷酰胺50 mg/d联合泼尼松(后逐渐减停)治疗,达到部分缓解(PR)。结论:CD4^(+)CD8^(-)T细胞大颗粒淋巴细胞白血病临床上极为罕见,与CD4^(-)CD8^(+)T-LGLL临床表现存在差异。

CD8^(+)CD28^(-)T细胞对单倍型造血干细胞移植后急性移植物抗宿主病的影响

目的:探讨CD8^(+)CD28^(-)T细胞对单倍型造血干细胞移植(haplo-HSCT)后急性移植物抗宿主病(aGVHD)的影响。方法:回顾性分析60例行haplo-HSCT的血液病患者移植后CD8^(+)CD28^(-)T细胞绝对计数与aGVHD的关系,并比较不同CD8^(+)CD28^(-)T细胞绝对计数组间慢性移植物抗宿主病(cGVHD)、感染及预后的差异。结果:60例行haplo-HSCT患者中有40例发生aGVHD,发生率为66.67%,中位发生时间为32.5(20-100)天。Haplo-HSCT后30天,aGVHD组CD8^(+)CD28^(-)T细胞绝对计数显著低于无aGVHD组(P=0.03)。ROC曲线表明移植后30天CD8^(+)CD28^(-)T细胞绝对计数在一定程度上可预测aGVHD的易感性。移植后30天低细胞计数组(CD8^(+)CD28^(-)T细胞绝对计数<0.06/μl)患者的aGVHD发生率显著高于高细胞计数组(CD8^(+)CD28^(-)T细胞绝对计数≥0.06/μl,P=0.011)。多因素Cox回归分析进一步验证了移植后30天CD8^(+)CD28^(-)T细胞绝对计数是aGVHD发生的独立风险因素,低细胞计数组aGVHD的发生风险是高细胞计数组的2.222倍(P=0.015)。不同CD8^(+)CD28^(-)T细胞绝对计数组间cGVHD、真菌感染、EB病毒感染、巨细胞病毒感染的发生无统计学差异。不同CD8^(+)CD28^(-)T细胞绝对计数组的总生存率、非复发相关死亡率、复发率没有显示出明显的统计学差异。结论:行haplo-HSCT后30天CD8^(+)CD28^(-)T细胞延迟重建的患者更易发生aGVHD,并且CD8^(+)CD28^(-)T细胞绝对计数在一定程度上可预测其易感性。单倍型造血干细胞移植后CD8^(+)CD28^(-)T细胞绝对计数与cGVHD、真菌感染、EB病毒感染、巨细胞病毒感染无关,且与移植后的生存预后无显著相关。

1565nm非剥脱点阵激光联合侧柏叶酊对斑秃小鼠IFN-γ信号及NKG2D^(+)CD8^(+)T细胞比例的影响

目的研究1565 nm非剥脱点阵激光联合侧柏叶酊干预对斑秃小鼠干扰素-γ(IFN-γ)信号与NKG2D^(+)CD8^(+)T细胞的影响。方法将50只雄性C3H/HeJ小鼠随机分为正常组、模型组、点阵激光组、侧柏叶酊组及点阵激光联合侧柏叶酊组,每组10只。除正常组外,其余组小鼠均采用环磷酰胺诱导斑秃。在造模期间,点阵激光组给予1565 nm非剥脱点阵激光治疗;侧柏叶酊组给予5%侧柏叶酊在脱毛部位轻微按摩2~3 min;点阵激光联合侧柏叶酊组给予1565 nm非剥脱点阵激光及5%侧柏叶酊按摩治疗。观察各组小鼠皮肤状态和毛发生长情况;实验第7天取血,流式细胞术检测血液中NKG2D^(+)CD8^(+)T细胞比例,Western blot法检测毛囊组织中IFN-γ及其受体IFNGR1和IFNGR2表达情况。结果模型组小鼠斑秃部位的毛发出现断裂、变细,裸露皮肤表面出现黑点;各干预组斑秃情况均较模型组轻,其中点阵激光联合侧柏叶酊组最轻。模型组血液中NKG2D^(+)CD8^(+)T细胞比例和毛囊组织中IFN-γ、IFNGR1、IFNGR2蛋白相对表达量均明显高于正常组(P均<0.05)。点阵激光组、侧柏叶酊组仅毛囊组织中IFN-γ蛋白相对表达量均明显低于模型组(P均<0.05),点阵激光联合侧柏叶酊组血液中NKG2D^(+)CD8^(+)T细胞比例和毛囊组织中IFN-γ、IFNGR1、IFNGR2蛋白相对表达量均明显低于模型组及点阵激光组、侧柏叶酊组(P均<0.05)。结论1565 nm非剥脱点阵激光联合侧柏叶酊外用可通过抑制IFN-γ信号通路和NKG2D^(+)CD8^(+)T细胞的积累,从而有效改善斑秃。

黄芪-莪术对Lewis肺癌小鼠肿瘤血管及肿瘤微环境中CD8^(+)T细胞的影响

目的 通过观察黄芪-莪术对肿瘤血管及肿瘤微环境中CD8^(+)T细胞及IFN-γ的影响,探讨黄芪-莪术促进肿瘤血管正常化的作用及其与调控CD8^(+)T细胞分化和IFN-γ释放的关系。方法 采用Lewis肺癌移植瘤小鼠模型,分为模型组、贝伐单抗组、PD-1抗体组与黄芪-莪术组共4组,每组各10只,分别给予无药溶剂或相应药物,连续14 d。第14天给药后超声造影观测各组小鼠肿瘤组织血流灌注情况,第15天取材经免疫荧光观测肿瘤组织血管结构,流式细胞术检测肿瘤组织中CD8^(+)T细胞情况,酶联免疫吸附试验检测肿瘤组织内免疫因子干扰素-γ(Interferon-γ,IFN-γ)、白介素-2(Interleukin-2,IL-2)及血管内皮生长因子A(Vascular endothelial growth factor A,VEGFA)、促血管生成素-2(Angiopoietin-2,Ang-2)、基质金属蛋白酶-9(Matrix metalloprotein-9,MMP-9)和整合素αvβ3(Intergrin αvβ3)含量,进行统计学分析。结果 与模型组比较,各用药组肿瘤体积增长较为缓慢(P<0.05),而黄芪-莪术组与贝伐单抗组相当,均优于PD-1抗体组(P<0.05)。超声检测显示,与模型组比较,各用药组肿瘤组织内造影剂呈现快进快出,黄芪-莪术组及贝伐单抗组与模型组比较上升支斜率大、达峰时间短,差异有统计学意义(P<0.05),说明血流灌注增速;黄芪-莪术组较PD-1抗体组上升支斜率大、达峰时间短(P<0.05),贝伐单抗组较PD-1抗体组达峰时间短(P<0.05)。免疫荧光检测显示,与模型组比较,各用药组肿瘤组织微血管密度降低、周细胞覆盖率提升(P<0.05)。流式细胞术检测显示,与模型组比较,黄芪-莪术组与PD-1抗体组CD28^(+)TCF^(+)细胞和CD8^(+)IFN-γ^(+)细胞比例均增加(P<0.05),贝伐单抗组较模型组CD28^(+)TCF^(+)细胞和CD8^(+)IFN-γ^(+)细胞比例增加,但差异无统计学意义(P>0.05);与贝伐单抗组比较,黄芪-莪术组升高CD8^(+)IFN-γ^(+)细胞比例更多(P<0.05),PD-1抗体组升高CD28^(+)TCF^(+)细胞比例更多(P<0.05);与PD-1抗体组比较,黄芪-莪术组CD28^(+)TCF^(+)细胞比例较低,CD8^(+)IFN-γ^(+)细胞比例较高,但差异均无统计学意义(P>0.05)。ELISA检测结果显示,与模型组比较,除贝伐单抗组IL-2水平外差异无统计学意义(P>0.05),各用药组肿瘤组织内VEGFA、Ang-2、整合素αvβ3、MMP-9水平均降低(P<0.01),免疫因子IFN-γ、IL-2水平均升高(P<0.05)。结论 黄芪-莪术能促进肿瘤血管正常化,抑制肿瘤生长,其机制可能与其促进肿瘤微环境中CD8^(+)T细胞向CD28^(+)TCF^(+)细胞分化、增加CD8^(+)IFN-γ^(+)细胞比例和IFN-γ含量有关。

Tim-3靶向CD8^(+)T细胞调控TNF-α/IL-22/STAT3通路加重自身免疫性肝炎小鼠肝损伤

目的探讨T细胞免疫球蛋白和黏蛋白结构域的分子3(Tim-3)对自身免疫性肝炎的影响及其机制。方法将30只小鼠分为3组:空白组、模型组和模型+Tim-3阻断组,每组10只。空白组经尾静脉注射等量生理盐水;其他两组尾静脉注射10 mg/kg刀豆蛋白A建立自身免疫性肝炎小鼠模型,造模成功后模型+Tim-3阻断组每天1次腹腔内注射液0.1 mg/ml Tim-3,注射7 d。HE染色观察小鼠肝组织病理改变;全自动生化分析仪检测血清AST、ALT;酶联免疫吸附法检测IL-22、TNF-α水平;流式细胞分析肝组织CD8^(+)T比例;实时荧光定量PCR检测肝组织Tim-3、IL-22、TNF-α、STAT3 mRNA相对表达;免疫印迹试验检测肝组织Tim-3、IL-22、TNF-α、STAT3蛋白相对表达。结果空白组小鼠肝脏组织无变化;模型组肝脏组织大面积性肝炎;模型+Tim-3阻断组见显著淋巴细胞浸润与大量空泡。与空白组比较,模型组和模型+Tim-3阻断组ALT、AST、IL-22、TNF-α水平均升高(P<0.05);与模型组相比,模型+Tim-3阻断组ALT、AST、IL-22、TNF-α水平升高(P<0.05)。与空白组比较,模型组和模型+Tim-3阻断组CD8^(+)T细胞比例表达均升高(P<0.05);与模型组相比,模型+Tim-3阻断组CD8^(+)T细胞比例下降(P<0.05)。与空白组比较,模型组和模型+Tim-3阻断组Tim-3、IL-22、TNFα、STAT3 mRNA及蛋白表达均升高(P<0.05);与模型组相比,模型+Tim-3阻断组Tim-3 mRNA及蛋白表达下降,IL-22、TNF-α、STAT3 mRNA及蛋白相对表达升高(P<0.05)。结论阻断Tim-3可下调CD8^(+)T细胞,促进TNF-α/IL-22/STAT3炎症信号表达,加重自身免疫性肝炎小鼠肝损伤。

肺癌细胞外泌体miR-24-3p调控CD8^(+)T细胞抗肿瘤的功能及机制研究

目的:探究肺癌细胞外泌体miR-24-3p调控CD8^(+)T细胞抗肿瘤的功能及机制。方法:将16HBE exo、A549 exo、H522 exo、H460 exo、miR-NC exo、miR-24-3p exo与CD8^(+)T细胞共孵育(16HBE exo组、A549 exo组、H522 exo组、H460 exo组、miR-NC exo组、miR-24-3p exo组),与PBS共孵育组(PBS组)作为对照,CD8^(+)T与miR-24-3p exo共孵育后转染FGF11质粒(miR-24-3p exo+FGF11组)。CCK8法检测CD8^(+)T细胞的增殖能力。双荧光素酶报告基因实验验证miR-24-3p和FGF11的靶向关系。将各组CD8^(+)T细胞与A549细胞以20∶1的比例共孵育4 h(16HBE exo/CD8^(+)T组、A549 exo/CD8^(+)T组、H522 exo/CD8^(+)T组、H460 exo/CD8^(+)T组、miR-NC exo/CD8^(+)T组、miR-24-3p exo/CD8^(+)T组、PBS/CD8^(+)T组、miR-24-3p exo+FGF11/CD8^(+)T组),Elisa检测共孵育后细胞上清中INF-γ和IL-2的浓度,LDH法检测CD8^(+)T细胞对A549细胞的杀伤能力。结果:相比于PBS组,A549 exo组、H522 exo组、H460 exo组CD8^(+)T细胞增殖能力显著降低(P<0.05)。A549 exo/CD8^(+)T组、H522 exo/CD8^(+)T组、H460 exo/CD8^(+)T组细胞上清中INF-γ和IL-2的浓度显著下降(P<0.001),CD8^(+)T细胞杀伤能力亦显著下降(P<0.001)。双荧光素报告基因检测结果显示FGF11为miR-24-3p的靶基因。miR-24-3p exo组CD8^(+)T细胞增殖能力显著低于miR-NC exo组,miR-24-3p exo+FGF11组CD8^(+)T细胞增殖能力显著高于miR-24-3p exo组(P<0.05)。miR-24-3p exo/CD8^(+)T组细胞上清中INF-γ和IL-2浓度及CD8^(+)T细胞杀伤能力均显著低于miR-NC exo/CD8^(+)T组(P<0.001), miR-24-3p exo+FGF11/CD8^(+)T组细胞上清中INF-γ和IL-2浓度及CD8^(+)T细胞杀伤能力显著高于miR-24-3p exo/CD8^(+)T组(P<0.001)。结论:肺癌细胞外泌体miR-24-3p可通过靶向抑制FGF11而抑制CD8^(+)T细胞的抗肿瘤功能。

LncRNA LINC01137通过诱导CD8^(+)T细胞耗竭促进非小细胞肺癌进展的机制研究

目的研究长链非编码RNA(long non-coding RNA,LncRNA)LINC01137在非小细胞肺癌(nonsmall cell lung cancer,NSCLC)免疫逃逸中的生物学功能及其潜在的调节机制。方法采集24例健康志愿者和24例NSCLC患者血液样本,并收集NSCLC肿瘤组织和癌旁组织检测LINC01137水平。利用Starbase数据库预测LINC01137与miR-22-3p的结合位点,荧光素酶报告基因分析进行验证。采用A549细胞来源的外泌体和/或sh-LINC01137干扰序列转染A549细胞,检测细胞增殖和侵袭能力;收集转染后的细胞上清液培养CD8^(+)T细胞,检测CD8^(+)T细胞耗竭标志物干扰素-γ(interfereron-γ,IFN-γ)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、颗粒霉素B(granzyme B)和白细胞介素-2(interleukin-2,IL-2)水平,以及PD-1+Tim3^(+)CD8^(+)T细胞百分比。采用外泌体和/或miR-22-3p模拟物(miR-22-3p mimic)转染CD8^(+)T细胞,检测PD-1蛋白水平。结果与癌旁组织相比,NSCLC肿瘤组织中LINC01137表达(3.357±0.548 vs 1.011±0.371)明显升高;与健康志愿者相比,NSCLC患者外周血LINC01137表达(3.216±0.342 vs 1.007±0.313)亦明显升高,差异具有统计学意义(t=-17.367,-17.147,均P<0.001)。肿瘤组织LINC01137表达与外周血中LINC01137表达呈正相关(r=0.755,P<0.05)。在A549细胞来源的外泌体中LINC01137显著富集。与Exo+sh-NC组相比,Exo+sh-LINC01137组细胞活力(65.852%±4.715%vs 100.153%±11.934%)及细胞侵袭(21.464%±3.481%vs 43.126%±1.447%)能力显著降低,差异具有统计学意义(t=4.630,9.953,均P<0.01)。NSCLC患者外周血中LINC01137表达和CD8^(+)T细胞百分比呈负相关(r=-0.520,P<0.05)。与Exo+sh-NC组相比,Exo+sh-LINC01137组IFN-γ(3865.314±543.852 pg/ml vs 1786.971±105.982 pg/ml),TNF-α(4631.930±510.715pg/ml vs 1973.242±379.623pg/ml),Granzyme B(3876.496±312.438pg/ml vs 1879.439±287.584pg/ml)和IL-2 mRNA水平(3.286±0.437 vs 1.015±0.314)升高,PD-1+Tim3^(+)CD8^(+)T细胞百分比(7.680%±2.185%vs 18.952%±3.216%)降低,差异具有统计学意义(t=-6.497,-7.237,-8.146,-7.310,5.021,均P<0.01)。miR-22-3p是LINC01137的靶基因。与Exo+NC mimic组相比,Exo+miR-22-3p组PD-1蛋白水平(0.384±0.087 vs 1.003±0.147)显著降低,差异有统计学意义(t=6.277,P<0.01)。结论NSCLC患者肿瘤组织及外周血中LINC01137表达显著上调;NSCLC细胞来源的外泌体中LINC01137通过靶向CD8^(+)T细胞中miR-22-3p并抑制其表达,诱导CD8^(+)T细胞耗竭,促进NSCLC细胞免疫逃逸。

LncRNA CCAT1调节miR-155表达增强CD8^(+)T细胞对食管癌抗肿瘤活性的机制研究

目的 研究长链非编码RNA结肠癌相关转录本1(long non-coding RNA colon cancer-associated transcript-1,LncRNA CCAT1)对CD8^(+)T细胞抗食管癌肿瘤活性的影响及其作用机制。方法 分离食管癌患者和健康受试者外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC),用qRT-PCR法分别检测PBMC中CCAT1和miR-155的表达。分别下调CCAT1和miR-155表达,采用流式细胞术检测CD8^(+)T细胞凋亡率,Western blot检测Cleaved Caspase 3蛋白表达,qRT-PCR检测IL-2 mRNA和IFN-γ mRNA基因表达,分析CD8+T细胞对食管癌细胞的杀伤作用。采用miRanda和双荧光素酶实验研究CCAT1与miR-155之间的相互作用。分析上调LncRNA CCAT1靶向miR-155对CD8^(+)T细胞凋亡率、杀伤作用及其Eca-109细胞增殖和迁移的影响。结果 食管癌患者PBMCs中CCAT1表达(2.58±0.28)高于健康受试者(1.35±0.34),miR-155表达(0.53±0.09)低于健康受试者(1.54±0.29),差异具有统计学意义(t=12.04,21.05,均P <0.05)。下调CCAT1后,CD8^(+)T细胞凋亡率(12.05%±0.28%)明显低于si-control组(19.86±0.45)%,CD8^(+)T细胞的细胞杀伤活性(0.49±0.05)%明显高于si-control组(0.34%±0.02%),差异具有统计学意义(t=9.82,-17.54,均P<0.05)。si-CCAT1组细胞内Cleaved Caspase 3蛋白表达(0.32±0.09)低于si-control组(1.37±0.72),IL-2 mRNA(2.38±0.47)和IFN-γ mRNA(3.28±0.26)表达高于si-control组(1.12±0.23,1.28±0.37),差异具有统计学意义(t=-20.05,-18.29,-19.86,均P<0.05)。CCAT1和miR-155之间存在互补碱基对,双荧光素酶实验结果显示CCAT1野生型和mi R-155模拟物共转染后miR-155 mimics组细胞荧光素酶活性(0.41±0.08)显著低于对照组(1.24±0.18),差异具有统计学意义(t=17.92,P<0.01)。下调miR-155后CD8^(+)T细胞凋亡率(24.87%±0.95%)明显高于inhibitor control组(18.24%±1.25%),CD8+T细胞的细胞杀伤活性(0.26%±0.06%)明显低于inhibitor control组(0.43%±0.05%),差异具有统计学意义(t=10.03,20.06,均P<0.05)。miR-155 inhibitor组细胞内Cleaved Caspase 3蛋白表达(1.07±0.23)高于inhibitor control组(0.42±0.02),IL-2 mRNA(0.73±0.26)和IFN-γ mRNA(0.54±0.18)表达低于inhibitor control组(1.39±0.08,1.16±0.24),差异具有统计学意义(t=18.75,19.27,18.35,均P<0.01)。上调CCAT1通过miR-155促进CD8^(+)T细胞凋亡并降低细胞杀伤活性,且促进了Eca-109细胞增殖和迁移。结论 LncRNA CCAT1在食管癌患者中表达显著上调,敲低CCAT1通过调节miR-155表达可抑制CD8^(+)T细胞凋亡,增强细胞的抗肿瘤活性。

PD-1抗体调节糖尿病大鼠CD8^(+)T细胞和Treg平衡促进糖尿病足溃疡愈合的疗效研究

目的:探讨PD-1抗体治疗糖尿病大鼠足溃疡的疗效及其作用机制。方法:将30只6~8周龄健康Sprague-Dawley大鼠随机分为对照组、模型组和治疗组,每组10只,三组大鼠足部人为造成溃疡创口。采用流式细胞术计数三组大鼠脾脏中CD8^(+)T细胞和调节性T细胞;Image J对创口照片进行分析计算伤口愈合率;HE染色和组织病理学分析溃疡创口处皮肤愈合情况;ELISA测定大鼠足部溃疡创口组织中TNF-α和IL-1β的水平。结果:与对照组相比,模型组大鼠CD8^(+)T细胞计数明显下调,Treg细胞计数明显升高(P<0.05);模型组大鼠足部溃疡创口愈合不佳,没有形成完整的新生表皮组织和肉芽组织,未见胶原沉积;模型组大鼠创口处组织中TNF-α和IL-1β的水平明显升高(P<0.05)。与模型组相比,治疗组大鼠CD8^(+)T细胞计数明显回升,Treg细胞计数明显回落(P<0.05);治疗组大鼠足部溃疡创口愈合良好,有较为完整的新生表皮组织、肉芽组织和一定的胶原沉积;治疗组大鼠创口处组织中TNF-α和IL-1β的水平明显降低(P<0.05)。结论:应用人源化PD-1抗体治疗糖尿病大鼠足溃疡具有明显的疗效。

癸酸能够活化CD8^(+)T细胞并提高其抗肿瘤免疫反应能力

目的:探究中链脂肪酸癸酸对CD8^(+)T细胞活化的影响,及其对CD8^(+)T细胞介导的抗肿瘤免疫反应的作用和机制。方法:建立C57BL/6小鼠黑色素瘤B16F10皮下荷瘤模型,随机分为癸酸组(10 mg/kg癸酸灌胃)和对照组(等量溶剂灌胃),观察癸酸对小鼠肿瘤生长以及生存率的影响,采用流式细胞术检测肿瘤微环境中浸润CD8^(+)T细胞的活化水平。建立B16F10-OVA和OT-I T细胞共培养体系,采用流式细胞术检测癸酸对CD8^(+)T细胞的肿瘤细胞杀伤能力的影响。采用α-CD8抗体清除B16F10荷瘤小鼠体内CD8^(+)T细胞,观察对小鼠肿瘤体积的影响。小鼠原代CD8^(+)T细胞经癸酸处理后,采用WB、ELISA及qPCR、流式细胞术检测T细胞受体(TCR)活化、效应细胞因子产生以及增殖和代谢水平。在B16F10荷瘤小鼠模型中,观察α-PD-1抗体联合癸酸给药对小鼠肿瘤生长以及生存率的影响。结果:在小鼠黑色素瘤荷瘤模型中,与对照组相比,癸酸组小鼠移植瘤体积显著降低且生存率显著提高(均P<0.05),肿瘤浸润CD8^(+)T细胞IFN-γ和TNF-α的表达水平显著升高(P<0.01)。经癸酸处理的OT-I T细胞对B16F10-OVA细胞的杀伤水平显著升高(P<0.01)。在荷瘤小鼠模型中用α-CD8抗体清除CD8^(+)T细胞后,癸酸对移植瘤的抑制作用显著降低(P<0.0001)。小鼠原代CD8^(+)T细胞经癸酸处理后,TCR活化水平显著升高、细胞因子IL-2和IFN-γ的产生增多、线粒体代谢水平显著上调(均P<0.05)。在黑色素瘤荷瘤小鼠模型中,癸酸与α-PD-1抗体联用,能够显著抑制小鼠移植瘤生长并提高其生存率(均P<0.05)。结论:癸酸能够促进CD8^(+)T细胞活化、增强其抗肿瘤免疫反应能力。

肝细胞癌肿瘤微环境细胞毒性T细胞PD-1的表达及其临床意义

目的探讨程序性细胞死亡蛋白1(PD-1)在肝细胞癌(HCC)肿瘤微环境细胞毒性T细胞中的表达及其临床意义。方法回顾性选取2012年1月至2020年12月入复旦大学附属中山医院青浦分院接受手术治疗的HCC患者344例为研究对象,手术切除HCC患者的癌组织,免疫组织化学双染色法检测PD-1的表达,依据PD-1的表达中位数水平分为PD-1高表达和PD-1低表达,分析PD-1表达与临床病理参数的相关性,采用Kaplan-Meier方法计算总生存率和无进展生存率并绘制生存曲线,采用多因素Cox回归分析HCC的预后影响因素。结果PD-1表达于HCC肿瘤浸润淋巴细胞的细胞膜和(或)细胞质上,肿瘤浸润淋巴细胞中PD-1的高表达率为43.9%(151/344);HCC肿瘤组中PD-L1的阳性表达率为21.8%(75/344);HCC肿瘤浸润免疫细胞中PD-L1的阳性表达率为47.1%(162/344);肿瘤浸润CD8^(+)T细胞高密度率为45.3%(156/344)。PD-1高表达与肿瘤组织学分级、肿瘤细胞PD-L1表达、CD8^(+)T淋巴细胞PD-L1表达、CD8^(+)T淋巴细胞密度有关(P<0.05)。PD-1高表达患者的总生存率为80.81%,明显低于PD-1低表达患者(88.95%),差异有统计学意义(P<0.05)。PD-1高表达患者的无病生存率为67.44%,明显低于PD-1低表达患者(84.30%),差异有统计学意义(P<0.05)。多因素Cox回归分析结果显示,肿瘤细胞PD-L1表达、肿瘤浸润免疫细胞PD-L1表达、CD8^(+)T淋巴细胞密度均为影响肝细胞癌患者预后的危险因素(P<0.05)。结论CD8^(+)T淋巴细胞中PD-L1具有较高的表达率,CD8^(+)T细胞PD-1高表达与肿瘤组织学分级、肿瘤细胞PD-L1表达、CD8^(+)T淋巴细胞PD-L1表达、CD8^(+)T淋巴细胞密度、总生存率和无病生存率显著相关,可作为HCC患者辅助诊断和预测预后的指标之一。

体外激活CD8^+T细胞表达CD69及γ-干扰素的研究

目的 :研究正常人外周血CD8+T细胞体外活化表达早期活化标志CD69分子及γ -干扰素 (IFN -γ)的规律 方法 :以佛波醇酯 (PDB) +离子霉素 (Ion)或植物血凝素 (PHA)体外活化人外周血单个核细胞 (PBMC) ,利用流式细胞术分析CD8+T细胞表达CD69及IFN -γ的情况 结果 :PDB +Ion和PHA活化CD8+T细胞CD69的表达率 ( % )分别为 78.4± 5.3和 2 7.4± 4 .4 ( x±s) ,明显高于对照组 ( 1.5± 0 .6) (P <0 .0 5) 当monensin存在时以PDB +Ion及PHA刺激 4h后IFN -γ阳性CD8+T细胞的百分比分别为 2 9.7± 6.5及 5.9± 1.8,均明显高于对照组 ( 0 .7± 0 .2 ) (P <0 .0 5) ,其中前者表达率高于后者 (P <0 .0 5) 结论 :PDB +Ion和PHA均可刺激CD8+T细胞表达CD69以及IFN -γ 。

GM-CSF基因修饰同种异体肺癌细胞疫苗诱导CD8^+ T细胞的免疫反应

目的探讨GM-CSF基因修饰同种异体肿瘤疫苗是否可诱导CD8+ T细胞的特异性免疫反应。方法以接种Lewis肺癌(Lewis Lung Cancer,LLC)细胞株的C57BL小鼠作为动物模型。利用含小鼠粒-巨细胞集落刺激因子(macrophage-colony-stimulating factor,GM-CSF)基因的重组质粒GM-CSF-pIRES2-EGFP,转染小鼠肺癌细胞株LA795,制备同种异体肿瘤疫苗。C57BL小鼠预防接种该疫苗3次后,皮下接种LLC细胞株,分别于免疫前、每次疫苗注射后采集小鼠脾淋巴细胞,采用ELISPOT法检测淋巴细胞经LLC抗原刺激后的活化;脾细胞及其中的CD8+ T细胞对LLC细胞株的杀伤活性;同时采用免疫组化方法检测注射部位淋巴细胞浸润情况。结果疫苗注射部位可见明显的CD8+T细胞浸润;经ELISPOT方法检测,GM-CSF基因修饰LA795疫苗接种后,小鼠脾淋巴细胞经LLC抗原刺激后活化细胞比例均显著升高(P<0.01);同时,脾细胞及其中的CD8+ T细胞对LLC细胞的杀伤活性明显升高(P<0.05)。结论GM-CSF分泌性同种异体瘤苗可诱导CD8+ T细胞的活化,以及对自体肿瘤细胞的杀伤,即可诱导特异性抗肿瘤免疫反应。

颅内动脉瘤破裂与CD8^+CD28^-调节性T细胞的关系

目的探讨CD8+CD28-调节性T细胞在颅内动脉瘤发生破裂中所起的作用。方法收集确诊未破裂动脉瘤患者20例,破裂者17例,采用流式细胞术检测其外周血CD8+CD28-调节性T细胞的百分含量;并选择16例正常人及12例脑胶质瘤患者作为对照。对未破裂的患者进行为期2年随访,观察CD8+CD28-T细胞的变化情况。结果健康对照组的CD8+CD28-T细胞含量为27.82%±3.59%,胶质瘤患者的含量为23.71%±8.21%,未破裂动脉瘤患者为13.87%±4.17%,而破裂者为6.93%±2.08%。破裂患者的CD8+CD28-T细胞水平显著低于未破裂者(t=-1.865,P=0.041),且两组动脉瘤患者均低于正常人(均为P<0.01),但胶质瘤患者与正常人与无统计学差异(P=0.117);经过2年随访,共有5例患者失访,在余下的15例患者当中有3例发生破裂(分别在第16、18及22个月发生破裂),此3例患者第1年末的CD8+CD28-T细胞含量已明显低于随访前(P<0.05),且发生破裂后该细胞的含量显著低于第一年末(P<0.05)。结论 CD8+CD28-调节性T细胞减少可能与动脉瘤发生破裂相关。

自身免疫性肝炎患者外周血CD8^+T淋巴细胞PD-1表达及意义

目的研究自身免疫性肝炎患者外周血CD8+T淋巴细胞程序性死亡受体1(PD-1)表达的变化。方法选择自身免疫性肝炎患者22例和健康人20例,使用流式细胞仪检测所有被研究者外周血CD8+T淋巴细胞PD-1分子的表达状况,比较不同分期和不同性别疾病患者PD-1表达水平。结果自身免疫性肝炎患者外周血CD8+T淋巴细胞PD-1分子阳性百分比为2.5±0.5%,显著高于健康对照组(0.5±0.1%,P<0.001);自身免疫性肝炎发病期患者CD8+T淋巴细胞表达PD-1百分比为2.6±0.7%,与缓解期比无统计学差异(3.4±0.8%);16例女性AIH患者外周血CD8+T淋巴细胞PD-1阳性百分比为3.5±0.7%,亦略高于6例男性患者的1.3±0.3%,但无显著统计学差异(P=0.1021),可能与例数较少有关。结论自身免疫性肝炎患者CD8+T淋巴细胞PD-1表达率增加,PD-1可能在自身免疫性肝炎的发病中起了重要作用。

多发性骨髓瘤患者外周血CD4^+ CD25^+和CD8^+ CD28^-调节性T细胞研究

目的:探讨CD4+CD25+和CD8+CD28-调节性T细胞(Tregs)在多发性骨髓瘤(MM)患者外周血中的变化及意义。方法:采用流式细胞术检测38例MM患者及20例健康对照外周血CD4+CD25+和CD8+CD28-Tregs水平。分别采用溴甲酚绿法、透射免疫比浊法测定患者血清白蛋白(Alb)、β2-微球蛋白(β2-MG)。结果:初诊MM患者外周血CD4+CD25+/high、CD4+CD25highCD127low及CD8+CD28-Tregs比率均明显升高;CD4+CD25+/high和CD4+CD25highCD127lowTregs比率在各临床分期均较对照组升高,随分期增高呈现增加趋势,且CD4+CD25high和CD4+CD25highCD127lowTregs在Ⅲ期患者显著高于Ⅰ期患者;CD8+CD28-Tregs在Ⅱ、Ⅲ期显著高于正常对照,且Ⅱ期高于Ⅰ期,Ⅲ期高于Ⅱ期,逐期递增,而在Ⅰ期与对照组比较无显著差异;CD4+CD25+/high和CD4+CD25highCD127lowTregs比率在进展期和稳定期均较对照组升高,但两期之间比较无明显差异,而CD8+CD28-Tregs在进展期高于稳定期及对照组,稳定期和对照组间比较无明显差异;CD4+CD25highTregs和CD4+CD25highCD127lowTregs比率与Alb水平均呈负相关。结论:MM患者体内存在CD4+CD25+Tregs和CD8+CD28-Tregs异常增加,可能是MM免疫逃逸的一个重要机制,这些变化同临床分期、病情进展及预后存在一定程度相关性。

重度寻常型银屑病患者外周血CD8^+T淋巴细胞CCR6及上清液中IL-22、IL-17的表达

目的研究重度寻常型银屑病患者外周血CD8+T细胞表面趋化因子受体CCR6表达及上清液中白细胞介素(IL)-22、IL-17的水平。方法流式细胞仪检测25例重度寻常型银屑病患者外周血中CD8+T淋巴细胞表面趋化因子受体CCR6的表达率,ELISA检测CD8+T细胞培养后上清液中IL-22、IL-17的水平,分别与30例健康对照者进行比较。结果银屑病患者外周血中CD8+T细胞表面CCR6的表达率为(94.76±2.38)%,健康对照组为(72.56±8.33)%,差异有统计学意义(P<0.05);经过anti-CD3单克隆抗体和anti-CD28单克隆抗体刺激后,10例银屑病患者外周血CD8+T细胞上清夜中IL-17、IL-22水平分别为(7.17±1.51)pg/m L、(102.42±15.34)pg/m L,健康对照组分别为为(2.68±1.12)pg/m L、(47.39±5.47)pg/m L,2组比较差异有统计学意义(均P<0.01)。结论银屑病中CCR6可能促进外周血CD8+T细胞趋化至皮损中;银屑病患者外周血CD8+T细胞在活化的状态下可促进炎症细胞因子的表达增加,加重银屑病的炎症反应。

补肾解毒通络方对EAE大鼠CD4^+、CD8^+ T细胞和IL-17的影响

目的探讨补肾解毒通络方对实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)大鼠外周血CD4^+、CD8^+T细胞和脑组织内白细胞介素(IL)-17的影响。方法将60只雌性Wistar大鼠按照随机数字表法分为空白对照组(正常)、模型对照组(EAE+生理盐水)、低剂量组(EAE+15 g·kg^(-1)·d^(-1))、中剂量组(EAE+30 g·kg^(-1)·d^(-1))及高剂量组(EAE+60 g·kg^(-1)·d^(-1))。模型建立后持续灌胃14 d。治疗结束后采用流式细胞术检测大鼠外周血CD4^+、CD8^+T细胞水平,采用免疫组织化学方法和阳性细胞计数检测各组大鼠侧脑室周围组织内IL-17水平。结果(1)与空白对照组相比,模型对照组大鼠CD4^+、CD4^+/CD8^+明显偏高,CD8^+明显偏低(P<0.05);与模型对照组、低剂量组及中剂量组相比,高剂量组大鼠CD4^+、CD4^+/CD8^+明显偏低,CD8^+明显偏高(P<0.05);高剂量组与空白对照组间比较差异无统计学意义(P>0.05)。(2)与空白对照组相比,模型对照组大鼠IL-17阳性细胞数明显偏高(P<0.05);与模型对照组、低剂量组相比,中剂量组和高剂量组明显偏低(P<0.05);高剂量组与空白对照组间比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论补肾解毒通络方60 g/kg剂量能更好地升高EAE大鼠外周血CD8^+T细胞同时降低CD4^+T细胞和IL-17阳性细胞数。

人体外周血CD3^+CD4^-CD8^-双阴性T细胞体外扩增的实验研究

目的探讨人体外周血CD3^+CD4^-CD8^-双阴性T细胞(DNT细胞)在体外进行分离和扩增的方法。方法取健康的成人外周血20ml,应用Rosettesep抗体吸附法去除CD4^+T细胞和CD8^+T细胞;再将DNT细胞放入anti-CD3mAb包被的培养板中,并加入rhIL-2、rhIL-4,共同培养,第10天和第14天计数细胞扩增倍数及记录扩增曲线;利用Easysep免疫磁珠法纯化,采用流式细胞仪检测其纯度。结果经分选、纯化后的DNT细胞,纯度可达94%以上;体外培养第10天和第14天,DNT细胞扩增倍数分别为53倍和41倍。结论通过Rosettesep抗体吸附法及Easysep免疫磁珠法分离及纯化DNT细胞是可行的,可获得大量高纯度的DNT细胞。