草鱼CD8α和CD207的表达及抗细菌免疫的功能研究

为探讨树突状细胞(Dendritic cells,DCs)表面重要的表型分子CD8α和CD207在草鱼(Ctenopharyngodon idella)DCs抗细菌免疫应答中的作用,实验从草鱼DCs的cDNA中扩增CD8α和CD207胞外区,构建重组表达质粒pET-32a-CD8α/CD207,并转化到感受态细胞Transetta(DE3),表达纯化后制备CD8α和CD207多克隆抗体。利用qPCR、Western Blot及流式细胞术揭示草鱼CD8α和CD207在抗细菌免疫过程中发挥的功能。结果显示,制备的草鱼CD8α和CD207多克隆抗体既可以识别原核表达的重组蛋白,也能识别鱼体内和培养细胞的内源性蛋白。从功能上看,灭活嗜水气单胞菌处理草鱼DCs后,在24h内,CD8α和CD207的表达量均有显著上调(P<0.05);且CD8α和CD207分子在草鱼DCs呈递抗原刺激混合淋巴细胞增殖这一过程中发挥重要作用。因此,草鱼DCs表现出与哺乳动物相似的保守免疫表型和功能,研究结果为阐明草鱼DCs介导的适应性免疫调节机制奠定基础。

麻鸭和樱桃谷鸭的CD3ε、CD4、CD8α基因ORF克隆及序列分析

【目的】分析比较中国部分品种鸭的CD3ε、CD4和CD8α基因ORF序列,为研究CD3ε链、CD4和CD8α链的结构和功能及其抗体的应用提供依据。【方法】利用RT-PCR,对麻鸭、樱桃谷鸭的CD3ε、CD4和CD8α基因ORF序列克隆测定,应用Clustal(X1.83)和DNAstar生物学软件分别与GenBank上公布的北京鸭CD3ε(AF378704)、CD4(AF378701)和CD8α(AF378373)基因ORF序列进行序列分析。【结果】麻鸭、樱桃谷鸭、北京鸭CD3ε和CD4基因ORF序列及所编码的氨基酸同源性为99%;北京鸭和麻鸭CD8α基因ORF序列同源性为99%,与樱桃谷鸭的同源性为95%。麻鸭和北京鸭CD8α基因ORF序基因编码的氨基酸完全一致,与樱桃谷鸭的CD8α存在16处位点差异,其中胞外区有15个氨基酸的差异,使亲水性、抗原性以及此区域位于蛋白质表面的可能性都有明显差异。从遗传发生树得出樱桃谷鸭、北京鸭、麻鸭CD3ε和CD4的ORF序列相互之间的遗传关系近;樱桃谷鸭、麻鸭和北京鸭CD8α基因ORF序列之间的遗传关系较远。【结论】樱桃谷鸭、北京鸭、麻鸭CD3ε和CD4的ORF序列遗传变异性低,樱桃谷鸭与麻鸭和北京鸭CD8α基因ORF之间具有较高遗传变异性。

CD8α在雄性牦牛主要免疫器官的分布

CD8α是细胞毒性T淋巴细胞重要的表面标志,广泛参与对MHCⅠ分子递呈抗原的识别和信号传递,对细胞免疫应答和防御机制至关重要。本研究采用RT-PCR方法克隆牦牛(Bos grunniens)CD8α编码区,通过实时荧光定量PCR、Western blot及免疫组织化学SP法,检测成年雄性牦牛的主要免疫器官(胸腺、脾、肠系膜淋巴结及血结)内CD8αmRNA及蛋白的表达。RT-PCR反应扩增得到牦牛CD8αmRNA序列编码区长为729bp,编码243个氨基酸,与黄牛有较高的同源性。实时荧光定量PCR和Western blot检测结果显示,CD8αmRNA及蛋白在各免疫器官中均有表达,且在胸腺表达量最高,在脾与血结表达量相似,二者表达量均高于肠系膜淋巴结(P<0.01)。免疫组织化学结果显示,CD8α阳性T细胞在胸腺皮质、髓质均有分布;在脾主要分布在动脉周围淋巴鞘和红髓髓索;肠系膜淋巴结及血结内,CD8α阳性细胞主要分布在淋巴小结周边及髓索。结果提示,牦牛胸腺的CD8α阳性T淋巴细胞输出量可能影响次级淋巴器官内T细胞含量;血结可能与淋巴结及脾一样,在细胞免疫发挥同等重要的作用。这些数据将为适时免疫、致病机理和疾病防治等研究提供新的资料。

中国部分地方品种鸡CD4和CD8α基因cDNA的克隆与序列分析

用Trizol分别提取4～6周龄白莱航鸡、狼山鸡、大骨鸡、北京油鸡、仙居鸡、茶花鸡、固始鸡和隐性白羽鸡胸腺细胞的总RNA，再用Oligo-dT纤维索富集mRNA后，用RT-PCR分别扩增出鸡CD4和cD8α基因cDNA。将PCR产物克隆进T载体后测序。序列分析显示不同品种鸡的CD4 cDNA序列完全一致；中国地方品种鸡与国外品种的白莱航鸡、RPL7系鸡在CD8α胞外区有6～13个氨基酸的差异，仙居鸡与其他5个中国地方品种鸡在CD8α胞外区有4～5个氨基酸的差异，狼山鸡、北京油鸡和隐性白羽鸡CD8α cDNA的核苷酸序列及推导的氨基酸序列完全一致。这些结果表明，中国地方品种鸡CD4基因序列高度保守；中国地方品种鸡与国外品种鸡的CD8α cDNA序列之间具有遗传多态性，而中国地方品种鸡之间CDSα cDNA序列遗传多态性低，为进一步研究CD4分子和CD8α链的结构和功能提供了条件。

东北白鹅CD8α基因的克隆及其胞外区基因的表达与抗血清的制备

根据GenBank公布的绿头鸭CD8α(AF378373)基因序列设计引物,通过RT-PCR获得东北白鹅CD8α基因。根据测序结果设计特异性引物,克隆得到东北白鹅CD8α胞外区基因,并在pET-30a(+)及pET-28a(+)/Rosetta(DE3)pLysS系统中进行原核表达。经IPTG诱导重组蛋白质获得表达,Ni-NTA柱亲和层析获得纯化的重组蛋白质,以纯化的重组蛋白质(pET-30a-CD8ex)为免疫原制备兔抗鹅CD8α胞外区抗血清。I-ELISA、Western blot分析表明抗血清可特异识别分离获得的东北白鹅外周血T淋巴细胞与重组蛋白质(pET-28a-CD8ex),间接免疫荧光试验证实,纯化的抗血清可特异性识别瞬时真核表达的鹅CD8α胞外区蛋白质。利用激光共聚焦显微镜观察到分离获得的鹅外周血淋巴细胞的细胞膜处出现明显的荧光信号。本研究结果说明制备的抗血清可作为鹅CD8+T淋巴细胞的检测试剂。

CD8α^+树突状细胞研究进展

根据细胞表面CD8α的表达差异,小鼠脾脏中树突状细胞(DC)可以分为2种,即CD8α-DC和CD8α+DC,二者功能迥异。本文回顾了近年来CD8α+DC的研究动向,重点分析了CD8α+DC的在肿瘤免疫、移植免疫和生殖免疫等中的作用。

暗纹东方鲀CD8α基因克隆、原核表达与多克隆抗体制备

CD8是与I型主要组织相容性复合体(MHC I)结合,是T细胞表面受体(TCR)的共受体,也是T淋巴细胞表面的重要标志物。该研究报道了暗纹东方鲀胸腺等组织中克隆获得CD8αcDNA序列及其相应的基因组序列。克隆到的cDNA序列全长1 061 bp,包含1个657 bp的开放读码框(ORF),编码218个氨基酸;其对应的基因组序列为1 533 bp,包含5个内含子和6个外显子。生物信息学分析表明,D8α蛋白质序列由信号肽、胞外可变区、铰链区、跨膜区和胞内区5部分组成。胞外区的可变区和铰链区部分各有两个高度保守的半胱氨酸残基,可能参与链内和链间二硫键的形成。氨基酸序列多重比对表明,暗纹东方鲀与其他鱼类的CD8α,特别是与鲽形目鱼类具有较高的同源性。为进一步研究暗纹东方鲀CD8的生物学功能,构建了表达CD8α成熟肽胞外区的重组质粒,诱导表达出重组蛋白。以纯化的重组蛋白为抗原免疫大白兔,制备了抗血清。经间接ELISA法检测抗体效价表明,获得了高效价的特异性暗纹东方鲀CD8α抗体,为进一步研究CD8在鱼类淋巴细胞进化和适应性免疫中的作用奠定了基础。

三黄鸡CD8α/βcDNA克隆与表达及其多克隆抗体的制备

为了获得鸡CD8α/β蛋白及其多克隆抗体,进一步研究其结构与功能,本实验从三黄鸡cDNA文库中克隆了其CD8α/β胞外区片段,构建了pQE30/ChCD8α/β原核表达系统,并经诱导表达、亲和层析纯化,获得了纯化的重组蛋白(rChCD8α/β),然后用rChCD8α/β分别免疫Balb/c小鼠制备了其多克隆抗体。结果表明:本实验克隆的ChCD8α长483 bp、编码161个氨基酸、可在E.coliJM109中高效表达,蛋白质分子质量为24.0 ku,表达量占菌体蛋白量的25.0%,由该蛋白质所制备的多克隆抗体抗rChCD8α的ELISA效价为1∶1 024 000;另外,克隆的ChCD8β长447 bp,编码149个氨基酸,蛋白质的分子质量为18.5 ku,表达量占菌体蛋白量的20.0%,抗rChCD8β多克隆抗体ELISA效价为1∶64 000。本实验所得鸡CD8α/β的多克隆抗体将用于四聚体研究。

编码鸡CD8α链无信号肽基因片段的克隆与表达

应用RT-PCR技术,通过自行设计的1对引物以ConA诱导的鸡胸腺淋巴细胞RNA为模板,扩增出编码鸡CD8α链的无信号肽基因片段,大小为651 bp。该片段经酶切初步鉴定后,被插入pMD18-T载体进行测序,发现与已发表的鸡CD8α链基因序列的同源性达98%。进一步将该片段插入原核表达质粒,构建pGEX-4T-1-CD8α,并转化大肠杆菌BL21。经IPTG诱导培养并提取表达蛋白质。在SDS-PAGE电泳图谱中可见大小约为50 000的蛋白带,表明所克隆的编码鸡CD8α链无信号肽基因片段在原核细胞中得到表达。

鲤主要免疫器官CD4L、CD8α和CD8β表达细胞的分布特征

自1975年在硬骨鱼类中发现T细咆存在的证据以来，单克隆抗体技术、免疫组化和原位杂交等技术的应用，使鱼类T细胞及其亚群和功能的研究成为可能。从20世纪80年代起，人们开始尝试通过各种方法例如用胸腺细胞、多聚甲醛同定的胸腺细胞（DLT15）、胸腺细咆膜（WCL9）、肠自细胞膜（WCL38）免疫小鼠进而制备抗鱼类T细胞的单克隆抗体。

北京鸭CD8α分子克隆与表达及其多克隆抗体制备

为了探讨鸭CTL免疫与病毒关系,本文用PCR技术从鸭cDNA文库中克隆了其CD8α基因(DuCD8α)。将DuCD8α成熟肽cDNA插入表达载体pQE30、构建了E.coliJM109(pQE30/DuCD8α)原核表达系。经诱导表达、蛋白纯化,制备了鼠抗DuCD8α多克隆抗体。结果表明DuCD8α成熟肽长645 bp,编码214个氨基酸。与已报道的DuCD8α在氨基酸水平上的同源性高达99.0%。SDS-PAGE证实重组DuCD8α(rDuCD8α)在JM109工程菌中的表达量可达15%。纯化的rDuCD8α分子量为26 kDa。ELISA结果显示鼠抗rDuCD8α多克隆抗体效价为1∶1 280 000。

鸡CD4和CD8α基因cDNA的克隆及其真核表达质粒的构建

用Trizol提取6周龄白莱航鸡胸腺组织的总RNA,再用Oligo-dT纤维素富集mRNA后,用RT-PCR分别扩增出鸡CD4和CD8α基因cDNA。PCR产物切胶回收后连入T载体,测序正确后再连入pcDNA3.1(+)。将重组质粒pcDNA3.1-CD4和pcDNA3.1-CD8分别转染COS-7细胞,用已知的抗鸡CD4和CD8的单克隆抗体检测到转染细胞中CD4和CD8α分子的表达,这说明构建的真核表达质粒正确,为下一步用DNA免疫方法研制抗鸡CD4和CD8的单克隆抗体以及研究鸡CD4和CD8分子的结构和功能打下基础。

CD8α^+树突状细胞介导的抗原交叉提呈作用与调控的研究进展

主要组织相容性复合体Ⅰ(MHCⅠ)分子提呈外源性抗原的方式称为抗原的交叉提呈作用,亦可启动CD8^+T细胞反应。小鼠淋巴组织包含一类表达CD8α以及其他特殊表面分子的树突状细胞(DC),该CD8α^+DC通过特殊的抗原摄取和加工处理方式对细胞相关抗原和可溶性抗原进行更高效的交叉提呈作用。我们主要总结了CD8α^+DC介导的抗原交叉提呈作用的细胞内机制、作用及调控的研究进展。

鸭CD8α基因启动子的分析及其转录活性

【目的】对鸭CD8α基因启动子活性区域进行分析,为鸭CD8α基因功能和表达调控机理研究提供依据。【方法】利用前期基因组步移技术获得的鸭CD8α基因的启动子区序列,制备一系列启动子缺失突变体(-625/-1 bp,-1 110/-1 bp,-1 413/-1 bp,-2 151/-1 bp),定向亚克隆至荧光素酶表达载体pGL3-Basic中,构建荧光素酶报告基因重组载体,采用Lipofectamine 2000将重组质粒瞬时转染DT40细胞,分析CD8α基因启动子系列缺失突变体在细胞内的转录活性。【结果】鸭CD8α基因5′侧翼区长片段具有较强的启动子活性,-1110—-625启动子活性最强,且-625—-1和-625—-1 110 bp区域均存在正调控元件。【结论】成功构建了荧光素酶报告基因真核表达载体,确定了鸭CD8α基因调控区,为进一步研究其转录调控机制奠定了基础。

鸭CD8α基因启动子区的克隆及荧光素酶报告基因重组体的构建

旨在了解分化群α基因可能的调控序列及其转录调控机制。本研究利用基因组步移技术扩增鸭CD8α基因的启动子区序列,使用在线软件进行序列分析;分别将鸭肝炎易感组和抗性组的CD8α基因启动子区定向亚克隆至荧光素酶表达载体pGL3-Basic中,利用酶切与测序技术进行鉴定;并瞬时转染细胞,采用荧光素酶报告基因系统检测启动子载体的活性。结果,扩增出一条长度为2 480bp的片段(包含第一外显子56bp,启动子区2 424bp)。经序列分析,鸭CD8α基因启动子区具有典型的TATA-box、GC-box和CAAT-box,其转录起始位点位于翻译起始密码子ATG上游-406bp处,且发现了CdxA、Nkx-2、GATA-1、SRY等41个潜在转录因子结合位点。经酶切与测序鉴定,成功构建了鸭CD8α基因荧光素酶报告基因重组体。荧光素酶报告基因检测系统显示,构建的鸭肝炎易感组和抗性组的报告基因启动子载体具有相当的活性。研究结果为进一步探讨CD8α基因的转录调控奠定了基础。

猪CD8α分子胞外区基因片段的原核表达

采用PCR技术从pGEM-pCD8α重组质粒中克隆了pCD8α胞外区去信号肽基因片段,并构建原核表达载体pET-30a-pCD8α-ED,在不同IPTG浓度和时间下进行诱导表达.结果表明:SDS-PAGE表达出约25ku的融合蛋白,目的蛋白主要以包涵体的形式存在,IPTG最佳诱导浓度为0.5mmoL·L-1,诱导6h时表达量达到峰值;Western-blot结果显示,在25ku左右出现杂交条带,表明表达的融合蛋白能被抗HIS标签的单克隆抗体识别,说明目的蛋白在大肠杆菌中得到了成功表达.

暗纹东方鲀CD8α全长cDNA的克隆及序列分析

根据红鳍东方鲀(Takifugu rubripes)的CD8α序列设计引物,用RACE技术克隆并测定了暗纹东方鲀(Takifugu fasciatus)CD8α全长cDNA序列,经序列比对两者同源性为97%。序列分析显示657 nt的开放读码框编码218个氨基酸残基的跨膜糖蛋白的前体蛋白,蛋白结构预测包括信号肽区、免疫球蛋白样结构域区、茎区、跨膜区和胞浆区。对其中胞外的免疫球蛋白样结构域区和茎区进行了原核表达,表达产物为22 ku左右的重组蛋白。

猪CD8α分子基因的克隆与初步鉴定

[目的]为了研究CD8分子的生物学功能。[方法]自行设计一对引物,从猪脾细胞中,克隆了猪CD8α链基因,获得大小为700 bp的基因片段,并对其进行鉴定。[结果]结果表明,该基因片段的核苷酸序列与已报道猪的同源性为99.2%,与豚鼠、人、猴子、猫和狗的同源性分别为35.6%、55.7%、55.6%、56.4%和56.8%。[结论]该研究为进一步研究CD8分子的生物学功能提供了依据。

1株抗鸡CD8α链单克隆抗体的鉴定

[目的]获得研究鸡CD8分子的单克隆抗体。[方法]用自行设计的引物PCR扩增鸡CD8分子α链部分基因片段,构建2个原核重组质粒,该片段经原核表达和纯化后免疫BALb/c小鼠,最后将免疫小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞融合,细胞上清液用ELISA检测。[结果]PCR扩增获得大小约为510 bp的基因片段。构建的pET-32a-CD8α导入大肠杆菌,诱导表达获得了大小为39 kD的融合蛋白H is-CD8α。融合细胞经亚克隆,其上清液用ELISA检测和筛选,获得1株稳定传代和分泌抗CD8α的抗体的杂交瘤细胞株。该株细胞被命名为C11。上清液的ELISA抗体效价达1:600。[结论]该研究以原核表达的CD8α为抗原制备了1株单克隆抗体。

可溶性 CD8α链基因克隆及序列分析

可溶性 CD8抗原(sCD8)是从 CD8^+细胞分泌或脱落至细胞外的白细胞分化抗原,sCD8与免疫调控和再生障碍性贫血等疾病有着密切关系。为从膜 CD8抗原基因中获得具有编码可溶性 CD8分子的基因,我们以 CD8抗原复合体分子的主要亚基α链基因为改构对象,采用逆转录重组 PCR 方法,在基因扩增的同时进行 DNA 重组拼接,除去编码 CD8α链穿膜序列的 DNA,从而克隆出 sCD8α链基因,并对重组的sCD8α链基因进行了序列分析.sCD8α链基因的克隆为进一步研究其表达及可溶性 CD8抗原在免疫调控中的功能奠定了基础.