基于CD80/CTLA⁃4途径探究IL⁃7对脓毒症T淋巴细胞功能的机制研究

目的基于CD80/CTLA⁃4途径探究IL⁃7对脓毒症T淋巴细胞功能的影响。方法选取我院2021年1月1日~2023年6月6日收治的104例脓毒症患者,分离患者外周血中T淋巴细胞并纯化,刺激培养T淋巴细胞并分为3组,即对照组、IL⁃7组和CYAL⁃4组。流式细胞仪分别检测T淋巴细胞凋亡率和增殖代数;ELISA检测淋巴细胞IL⁃7、IFN⁃γ、TNF⁃α水平;流式细胞仪检测淋巴细胞表面CD80表达;免疫荧光法检测T淋巴细胞表面CTAL⁃4表达。结果与对照组相比,IL⁃7组和CTAL⁃4组T淋巴细胞凋亡率明显降低(分别为45.17±4.02、48.06±4.08),T淋巴细胞增殖代数(分别为6.01±1.04、5.92±1.02)、T淋巴细胞中IL⁃7(分别为115.46±9.07、112.39±9.01)、IFN⁃γ(分别为21.46±2.15、20.07±2.12)、TNF⁃α(分别为347.15±2.26、340.87±12.08)水平明显增加(P<0.05);但IL⁃7组T淋巴细胞凋亡率、增殖代数、IL⁃7、IFN⁃γ、TNF⁃α水平和CTAL⁃4组相比差异无统计学意义(P>0.05)。与对照组相比,IL⁃7组和CTAL⁃4组T淋巴细胞中CD80(分别为6.28±0.87、6.31±0.89)和CTAL⁃4阳性率(分别为3.68±0.57、3.65±0.55)明显降低(P<0.05);IL⁃7组T淋巴细胞中CD80和CTAL⁃4阳性率和CTAL⁃4组相比差异无统计学意义(P>0.05)。结论IL⁃7可抑制脓毒症患者T淋巴细胞凋亡,促进T淋巴细胞增殖,促进T淋巴细胞中IL⁃7、IFN⁃γ、TNF⁃α水平,其作用机制可能与抑制CD80/CTLA⁃4途径有关。

原发性肾病综合征儿童尿液CD80表达水平对临床预后价值研究

目的探讨尿CD80在原发性肾病综合征(primary nephrotic syndrome,PNS)患儿中的表达水平及其对预后的影响。方法选择2016年1月~2017年12月宜宾市第一人民医院收治的73例PNS患儿为病例组,根据病理类型分为膜性肾病组(MN组,n=41)、微小病变肾病组(MCD组,n=32),并于同期随机选取40例健康体检儿童为对照组。检测并比较各组尿CD80,24h尿蛋白、血肌酐(SCr)和血尿素氮(BUN)水平,计算并比较肾小球滤过率估计值(eGFR)。采用Pearson积矩相关分析法分析尿CD80与SCr,BUN,24h尿蛋白和eGFR的相关性。受试者工作特征(ROC)曲线分析尿CD80对MN组和MCD组的鉴别诊断价值。采用Kaplan-Meier生存曲线分析尿CD80与MN组和MCD组患儿肾损伤进展的关系。结果病例组SCr(135.72±25.86μmol/L),BUN(8.52±3.19mmol/L),24h尿蛋白(3.79±1.24g/24h)和尿CD80(503.75±86.24ng/g)水平高于对照组(49.18±23.04μmol/L,3.51±2.67mmol/L,1.12±0.95g/24h,129.22±77.13ng/g),差异均有统计学意义(t=17.662,8.416,11.823,22.901,均P<0.05);eGFR水平低于对照组(92.39±18.51ml/min/1.73m^(2)vs 145.72±20.41ml/min/1.73m^(2)),差异有统计学意义(t=14.129,P<0.05)。MCD组患儿SCr(167.25±28.61μmol/L),BUN(9.82±3.64mmol/L),24h尿蛋白(6.21±1.38g/24h)和尿CD80(623.50±92.31ng/g)水平高于MN组(105.49±24.17μmol/L,7.51±4.02mmol/L,2.43±1.19g/24h,358.12±85.46ng/g),差异均有统计学意义(t=9.993,2.546,12.556,12.715,均P<0.05);eGFR水平低于MN组(78.05±22.90ml/min/1.73m^(2)vs 118.67±18.03ml/min/1.73m^(2)),差异有统计学意义(t=8.483,P<0.05)。Pearson积矩相关分析,MN组、MCD组尿CD80与SCr,BUN和24h尿蛋白均呈正相关性(r=0.392~0.649,均P<0.05),与eGFR呈负相关性(r=-0.579,-0.593,均P<0.05)。ROC曲线结果显示,尿CD80鉴别诊断MN组和MCD组的AUC为0.811(95%CI:0.785~0.839),截断值为492.65ng/g,约登指数为0.59,敏感度和特异度分别为81.25%,78.05%。尿CD80<352.76ng/g的MN组患儿未发生慢性肾病综合征(chronic kidney disease,CKD)的中位生存时间长于尿CD80≥352.76ng/g的MN组患儿(2.37年vs 2.01年),差异有统计学意义(χ^(2)=12.531,P<0.05)。尿CD80<631.50ng/g的MCD组患儿未发生CKD的中位生存时间长于尿CD80≥631.50ng/g的MCD组患儿(1.92年vs 1.55年),差异有统计学意义(χ^(2)=9.286,P<0.05)。结论PNS患儿尿CD80表达上调,有助于鉴别诊断PNS病理类型和预测预后不良。

基于SPR技术的抗CD80生物技术药物结合活性方法的建立

目的基于表面等离子共振(SPR)技术建立抗CD80生物技术药物结合活性方法,并进行方法学验证和样品测定。方法通过优化试验条件建立合适的结合活性方法,并选择合适的数据分析模型后对建立的方法进行方法学验证。结果通过对各种条件进行筛选及耐用性考察,确定了方法的试验参数:配体固定条件为pH 5.0的醋酸盐缓冲液,固定量为400~5000 RU,结合和解离速率为10~50μL·min^(-1),芯片的再生条件为pH 4.0的枸橼酸缓冲液(10 mmol·L^(-1)枸橼酸钠,100 mmol·L^(-1)NaCl),响应参数为稳态相对响应值(在进样结束后10 s范围内窗口的平均响应值),数据模型为四参数模型。根据以上参数建立了基于SPR技术抗CD80生物技术药物结合活性方法。验证结果如下:线性回归方程的决定系数为0.9994;每个效价水平相对效价测定值的相对偏倚平均值为-0.66%~0.64%,线性回归方程的斜率为0.9867;每个效价水平6次独立测试结果的几何变异系数为0.7%~1.5%,范围为64%~156%。各项验证指标均满足相关验证要求,专属性结果也较好。将建立的结合活性方法应用于抗CD80生物技术药物,测得结合活性相对效价为100%。结论本研究通过优化试验条件建立了基于SPR技术的抗CD80生物技术药物结合活性方法,该方法专属性强、重复性好、准确度高。

可溶性sCD80-Linker-sCD40L融合蛋白诱导非特异性抗肿瘤免疫

目的:观察可溶性sCD80-Linker-sCD40L融合蛋白对体外非特异性抗肿瘤免疫的影响。方法:以含sCD80-Lin- ker-sCD40L、sCD80、sCD40L编码基因的重组腺病毒载体或对照病毒载体转染人卵巢癌细胞SKOV3,ELISA检测上清中可溶性sCD80-Linker-sCD40L融合蛋白及sCD80、sCD40L蛋白的表达。由卵巢癌患者外周血单个核细胞培养树突状细胞(dendritic cells,DCs),将DCs和自体T细胞共同培养并加入不同上清诱导48h;用异基因混合淋巴细胞反应(mixed lymphocyte reaction,MLR)检测诱导的DCs刺激淋巴细胞增殖能力;以诱导的T细胞为效应细胞,SKOV3细胞或K562细胞为非特异性靶细胞,通过乳酸脱氢酶(lactate dehydrogemse,LDH)释放实验检测杀伤活性。结果:ELISA检测证实病毒转染SKOV3细胞上清中sCD80-Linker-sCD40L融合蛋白、sCD80蛋白和sCD40L蛋白表达量分别为2.791 ng/ml、1.956 ng/ml和1.407 ng/ml。MLR证实,与对照相比,融合蛋白上清诱导的DCs[刺激-反应细胞比例1:100,(0.382±0.053)vs(0.167±0.028),P<0.01;刺激-反应细胞比例1:50,(0.636±0.164)vs(0.311±0.067),P<0.01;刺激-反应细胞比例1:10,(1.245±0.271)vs(0.423±0.156),P<0.01]和sCD40L上清诱导的DCs[刺激-反应细胞比例1:100,(0.341±0.062)vs(0.167±0.028),P<0.01;刺激-反应细胞比例1:50,(0.567±0.106)vs(0.311±0.067),P<0.01;刺激-反应细胞比例1:10,(1.098±0.263)vs(0.423±0.156),P<0.01]刺激同种异基因混合淋巴细胞增殖能力明显增强。LDH释放实验提示,sCD40L上清诱导的T淋巴细胞对靶细胞非特异性杀伤活性显著强于对照SKOV3组[(42.28±6.27)vs(22.49±3.56),P<0.01]和K562组(47.94±6.72)vs (26.33±2.89),P<0.01],而融合蛋白上清诱导的T淋巴细胞对靶细胞非特异性杀伤活性显著强于sCD40L上清诱导的T淋巴细胞[sKOV3组为(58.97±8.92)vs(42.28±6.27),P<0.05;K562组为(66.55±9.43)vs(47.94±6.72),P<0.05]。结论:可溶性sCD80-Linker-sCD40L融合蛋白能有效诱导体外非特异性抗肿瘤免疫,对肿瘤免疫治疗具有潜在应用价值。

CD80人-鼠嵌合抗体对B淋巴瘤细胞株Raji与Daudi的生长抑制及杀伤作用

目的:研究CD80人-鼠嵌合抗体(命名为ch-4E5)对天然高表达CD80分子的人恶性B淋巴瘤细胞株Raji与Daudi的生长抑制及杀伤作用。方法:采用免疫荧光及流式细胞术(FCM)分析ch-4E5对Raji及Daudi细胞膜型CD80分子的识别;将ch-4E5分别加入到Raji及Daudi中共培养,终浓度为10mg/L。在培养的第0、4、10、16、24及48h,采用FCM检测细胞表面Fas及FasL的表达;培养至72h,MTT法检测细胞的增殖;以人外周血PBMC为效应细胞,Raji与Daudi为靶细胞,效靶比为20∶1,加入ch-4E5,终浓度为10mg/L。培养至24h,MTT法分析ADCC效应。结果:ch-4E5与Raji及Daudi的阳性结合率分别为98.6%和96.4%。ch-4E5分别与Raji及Daudi共培养至4h,Raji细胞表面FasL的表达开始上调,16h的阳性表达率为16.8%,与人IgG1对照组1.5%比较明显升高(P<0.01);Fas的表达从10h起逐渐增高,24h达高峰,阳性表达率为15.6%,与人IgG1对照组4.5%比较具有统计学意义(P<0.01)。Daudi的FasL及Fas的变化趋势与Raji一致。ch-4E5分别与Raji及Daudi共培养至72h,细胞增殖的抑制率分别为34.60%和32.64%(P<0.01);ch-4E5介导PBMC对Raji及Daudi的杀伤率分别为55.61%及54.42%(P<0.01)。结论:CD80人-鼠嵌合抗体能够通过其Fab段及Fc段发挥双重的抗肿瘤效应。

CD80鼠-人嵌合抗体的CHO细胞表达及体外生物学功能的初步研究

目的:CHO细胞表达抗人CD80鼠-人嵌合抗体ch4E5,并研究其在体外阻断CD80介导的共刺激信号转导的生物学功能。方法:构建含有嵌合重、轻链基因的表达载体pIRES/ch4E5;表达载体先转染293T细胞,FCM检测到ch4E5抗体的瞬时表达后,表达载体再转染CHO细胞,构建稳定表达细胞株CHO-ch4E5;ProteinG亲和层析法从CHO-ch4E5细胞无血清培养上清中纯化ch4E5抗体,FCM检测ch4E5抗体对膜型CD80的识别;以丝裂霉素处理的正常人外周血单核细胞PBMCs为刺激细胞,以异体正常人外周血淋巴细胞PBLs为反应细胞,用MTT法分析ch4E5抗体的阻断作用。结果:ch4E5抗体在293T细胞的瞬时表达于48小时达到高峰,上清与L929-B7-1细胞结合率为96.0%;CHO-ch4E5细胞持续表达ch4E5抗体,其培养上清与L929-B7-1细胞结合率为95.7%;3天培养上清中,ch4E5抗体的产率约为5.56mg/L;ch4E5抗体和L929-B7-1、Daudi、Sub-T细胞结合率分别为94.1%、25.7%、23.5%;ch4E5抗体可以阻断CD80介导的共刺激信号转导,抑制异体PBLs的体外增殖。结论:在CHO细胞中成功表达了抗人CD80鼠-人嵌合抗体ch4E5,在体外该嵌合抗体具有亲本抗体阻断CD80介导的共刺激信号的生物学活性。

腺病毒介导的肝癌靶向SEA-CD80基因治疗及免疫学机制的初步研究

目的:观察肝癌靶向性葡萄球菌肠毒素A(SEA)/CD80基因重组腺病毒载体对肝癌的疗效,并对其免疫学机制进行初步研究。方法:利用AdEasy腺病毒系统分别构建并制备甲胎蛋白(AFP)启动子和增强子Ⅰ调控的SEA和/或CD80基因重组腺病毒载体,然后采用瘤体内直接注射的方式对小鼠皮下移植性肝癌进行治疗,采用RT-PCR和Western blot方法检测腺病毒注射部位的SEA和CD80 mRNA和蛋白的表达情况;采用ELISpot方法和LDH释放实验分别检测脾脏淋巴细胞中肝癌特异性IFN-γ分泌细胞的频数和细胞毒性T细胞(CTLs)对Hepa1-6细胞的特异杀伤活性;通过观察荷瘤小鼠经治疗后肿瘤体积的变化及生存时间,评价重组腺病毒对肝癌的治疗作用。结果:我们构建的腺病毒能够使SEA和/或CD80 mRNA和蛋白靶向地在肝癌组织中表达;与空载体组和PBS对照组相比,双基因组和单基因组分泌IFN-γ的T细胞数量均明显增多,CTL对Hepa1-6细胞的特异性杀伤作用均明显增强,荷瘤小鼠肿瘤体积明显减小,生存期明显延长;双基因组的疗效和对免疫系统的激活作用明显高于单基因组;CD80和SEA的组之间、空载体和PBS组之间无明显差异。结论:我们制备的肝癌靶向性重组腺病毒对肝癌有良好的治疗作用,联合基因治疗优于单个基因治疗。

过敏性紫癜患儿外周血树突状细胞IL-6、IL-12的分泌及CD80、CD86的表达

目的探讨树突状细胞(dendritic cell,DC)在小儿过敏性紫癜(Henoch-Schnlein purpura,HSP)发病中的可能作用及机制。方法采集33例过敏性紫癜患儿和20例正常对照组儿童的外周血,以Thomas法,采用粒-巨噬细胞集落刺激因子、白介素4(IL-4)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)联合培养诱导DC细胞,检测DC协同刺激分子B7-1(CD80)、B7-2(CD86)的表达,及其分泌的IL-6、IL-12水平的变化。结果过敏性紫癜患儿外周血DC分泌IL-6水平[(274.4±51.2)ng/L]明显高于对照组[(154.3±46.4)ng/L],差异有高度统计学意义(t=8.05,P<0.01);外周血DC分泌IL-12水平[(89.6±17.7)ng/L]明显低于对照组[(129.4±18.2)ng/L],差异有高度统计学意义(t=6.03,P<0.01);同时过敏性紫癜患儿外周血协同刺激分子B7-2(CD86)的表达水平(51.2±7.4)明显高于对照组(37.3±6.5),差异有高度统计学意义(t=7.92,P<0.01)。结论DC可能通过诱导Th1/Th2细胞分化在小儿过敏性紫癜发病中起重要作用,其可能的机制系通过DC细胞分泌的细胞因子而起作用。

黄芩及其成分对RU486诱导小鼠流产的保胎作用及脾脏CD80^+、CD86^+细胞数量的影响

为了研究共刺激分子CD80(B7-1)、CD86(B7-2)在流产发生机制中的意义,探讨中药黄芩及其成分的安胎作用及机理,本试验用米非司酮(RU486)皮下注射(每鼠90μg)诱导BALB/c小鼠流产,流式细胞仪测定脾脏中CD80+、CD86+细胞的数量。发现RU486诱导流产的小鼠脾脏中CD80+细胞显著升高,CD86+细胞显著减少。预先经口给予保胎中药黄芩及其单体成分黄芩苷和黄芩素,则能显著抑制RU486的流产作用,使母鼠胚胎吸收率降低,脾脏中CD80+细胞数量显著降低,CD86+细胞数量显著升高。这些结果表明,RU486诱导流产与机体共刺激分子CD80+、CD86+有关。保胎中药黄芩及单体成分有调节共刺激分子CD80+、CD86+细胞数量的作用。

不同剂量X射线照射对小鼠巨噬细胞表达CD80和CD86的影响

采用免疫组织化学法观察了X射线全身照射对小鼠腹腔巨噬细胞及体外照射对培养的小鼠巨噬细胞株J774A .1细胞表达CD80和CD86的影响。结果表明 ;全身照射和体外照射时 2GyX射线诱导CD80表达增高均较 0 .0 75Gy为早 ,而CD86对两种剂量的反应无明显区别。剂量效应关系的研究表明 ,CD80和CD86的表达无论全身照射或体外照射时均在 0 .0 75Gy剂量点出现峰值 ,而在较大剂量照射时出现第二个峰值的剂量则全身照射高于体外照射。实验结果显示 。

抗人CD80单链抗体的构建、表达及与抗原结合的特性分析

目的:构建及表达抗人CD80单链抗体(ScFv),并初步研究其生物学功能。方法:采用RT-PCR法从分泌鼠抗人CD80mAb的杂交瘤细胞株(4E5)中克隆VH和VL基因。用重叠延伸拼接PCR方法构建具有前导肽的L-VH-Linker-VL单链抗体基因,并亚克隆至pIRES2-EGFP表达载体,脂质体法转染中华仓鼠卵巢细胞(CHO),G418加压筛选。纯化抗CD80-ScFv,并分析其对膜型CD80的识别。竞争抑制实验分析抗CD80-ScFv与相应抗原的结合能力。MTT法体外分析抗CD80-ScFv对CD80介导的共刺激信号的阻断作用。结果:构建的抗CD80-ScFv基因全长为828 bp,经测序含有信号肽和连接肽。实验获得稳定表达细胞株SA-Ⅱ,其培养上清与L929-CD80细胞的阳性结合率达98%以上。抗体纯化后产率约为15.12 mg/L,其能够识别Raji和Daudi细胞天然表达的CD80分子,结合率分别为96.6%和95.0%。抗CD80-ScFv对鼠源亲本抗体4E5与抗原结合的竞争抑制率达98.67%,并能阻断CD80介导的共刺激信号转导,抑制PBMC的增殖,增殖率下降43.48%。结论:成功建立了抗CD80-ScFv CHO细胞的表达株(命名为SA-Ⅱ),该抗体能够特异识别细胞表面膜型CD80分子并介导相应的生物学功能。

慢性乙型肝炎患者外周血树突细胞CD40、CD80表达和免疫活性的体外研究

目的 :探讨慢性乙型肝炎患者DC表面协同刺激分子CD4 0和CD80表达与其抗原呈递功能的关系 ,为进一步研究慢性乙型肝炎的发病机制及治疗提供新的思路。方法 :分离培养慢性乙型肝炎患者和健康人外周血DC ,流式细胞仪测定DC表面CD4 0和CD80的表达 ,混合淋巴细胞反应测定两组DC的功能。结果 :慢性乙型肝炎患者DC表面CD4 0和CD80的表达较健康人低 ,刺激同种异种T细胞增殖反应也较健康人低。结论 :乙肝病毒感染可通过抑制患者DC表面CD4 0、CD80等协同刺激分子的表达 。

人CD80-Linker-SEA重组毒素的设计及生物学特性预测

目的 :构建人重组CD80 Linker SEA毒素的真核表达载体并预测Linker的合理性和可行性。方法 :应用核酸和蛋白质序列分析软件GolgKey对融合基因及Linker部位翻译后在二级结构水平上的一些生物学特性 ,诸如柔性、抗原性、亲水性及表位等加以预测。结果 :CD80 Linker SEA融合基因的氨基酸序列经软件分析 ,并分别与CD80和SEA单独的分析结果相比较 ,发现在二级结构的水平未出现新的抗原性 ,同时在Linker部位具有很低的抗原性 ,亲水性没有改变 ,Linker部位呈中性 ,CD80和SEA具有原来各自的表位特征 ,无新的表位出现。结论 :本研究通过计算机软件对CD80 Linker SEA融合蛋白的预测 ,并与CD80、SEA各加以对比分析和比较 ,以利于在重组过程中有一个合理的设计 。

系统性红斑狼疮患者血清中IL-10抑制抗原递呈细胞表面HLA-DR和CD80的表达

目的:研究系统性红斑狼疮(systemiclupuserythematosus,SLE)患者血清中的IL-10对正常单核细胞分化形成的树突状细胞(dendriticcells,DCs)及其前体单核细胞抗原递呈相关膜表面分子表达的影响。方法:分离正常人外周血单个核细胞(PBMC),并采用GM-CSF+IL-4方案诱导分化形成DCs,在此过程中加入不同IL-10水平的SLE患者血清或混有IL-10中和抗体的SLE患者血清,联合培养7天后收集细胞,经形态学鉴定,以流式细胞术检测HLA-DR、CD80、CD86的表达。结果:在SLE血清的作用下,DCs的HLA-DR、CD80的表达下调,CD86表达不受影响;中和SLE血清中的IL-10后,HLA-DR、CD80表达能够恢复。其前体细胞单核细胞的HLA-DR、CD80的表达也可被SLE血清下调,用中和抗体中和IL-10后,其表达可部分恢复。结论:高IL-10水平的SLE血清能够抑制DCs及其前体单核细胞表面分子HLA-DR、CD80的表达,对抗原递呈细胞的功能可能产生影响。

猪圆环病毒2型感染对猪CD80和CD86 mRNA表达的影响

通过构建猪共刺激分子CD80和CD86的缺失cDNA竞争分子,用竞争PCR技术定量检测了猪圆环病毒2型(PCV2)感染后猪肺泡巨噬细胞(PAM)中CD80和CD86的mRNA水平,分析了PCV2感染对猪共刺激分子CD80和CD86的mRNA表达的影响。结果显示,PCV2感染后,PAM中CD80和CD86的mRNA水平变化趋势一致,只是CD86的升降幅度更大。在PCV2感染后3d,CD80与CD86的mRNA水平下降至最低,随后迅速上升,至14d达到高峰,尔后快速下降,21d及以后恢复正常。本研究结果表明,PCV2初期可明显抑制猪共刺激分子CD80和CD86的基因转录。

PRRSV和PCV2共感染对猪肺泡巨噬细胞CD80-CD86 mRNA转录的影响

用猪生殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)与猪圆环病毒2型(PCV2)共感染40日龄健康大白仔猪,利用实时荧光定量PCR技术对共感染仔猪肺泡巨噬细胞(PAM)共刺激分子CD80-CD86的mRNA转录水平进行了定量分析。结果表明,在感染后第3 d和第7 d CD80与CD86 mRNA转录显著下调(P<0.05),感染后第14 d CD86 mRNA转录水平仍低于未感染对照组。尽管CD80 mRNA转录水平在第14 d和第28 d高于对照组,CD86 mRNA转录水平在第28 d高于对照组,两者在第42 d均高于对照组,但无显著差异。证实,PRRSV和PCV2共感染可导致猪肺泡巨噬细胞的共刺激分子CD80-CD86基因转录在感染早期明显受到抑制,PAM的抗原呈递能力受到影响。

SEA-CD80基因过表达Hepa1-6肝癌细胞体外诱导的免疫学效应

目的观察经SEA和CD80重组腺病毒感染Hepa1-6肝癌细胞后体外能否诱导抗肿瘤免疫学反应。方法 Hepa1-6细胞分别经空载体腺病毒Ad(空)和重组腺病毒Ad-MMRE-mTERT-B7、Ad-MMRE-mTERT-SEA、Ad-MMRE-mTERT-BIS感染后,和小鼠脾淋巴细胞共培养,然后采用Brdu酶联免疫法(ELISA)检测淋巴细胞增殖;流式细胞术检测T淋巴细胞亚群增殖;ELISA法检测细胞因子IL-2、TNF-α和IFN-γ的产生;LDH释放法检测CTLs对Hepa1-6的杀伤作用。结果与感染空载体腺病毒Ad(空)和未感染Hepa1-6细胞相比,经重组腺病毒感染的Hepa1-6细胞体外能够显著诱导脾淋巴细胞的增殖,其中CD3+CD4+和CD3+CD8+T淋巴细胞增殖显著;细胞因子TNF-α、IFN-γ和IL-2的产生显著升高;CTLs对肿瘤细胞的杀伤活性显著增强;双基因过表达Hepa1-6细胞体外诱导的免疫应答高于单基因过表达Hepa-6细胞。结论 Hepa-6细胞经重组腺病毒感染后,表达在细胞膜上的SEA和CD80均具有免疫学活性,为今后采用所构建重组腺病毒进行肿瘤的免疫基因治疗提供了实验依据。

转染人CD80基因的黑色素瘤细胞生长特性及免疫原性探讨

目的：初步探讨弱免疫原性肿瘤细胞导入ＣＤ８０ 基因后免疫源性是否增强，以及肿瘤免疫原性与细胞表面分子的关系。方法：通过脂质体介导将ＣＤ８０ 基因导入小鼠黑色素瘤Ｂ１６ 细胞后，利用ＳＡＢＣ 法检测ＣＤ８０ 的表达；ＭＴＴ 法测定肿瘤细胞体外增殖能力；将肿瘤细胞接种至同源小鼠皮下后观察成瘤期、荷瘤小鼠存活期及肿瘤结节生长速度；在同源淋巴细胞肿瘤细胞混合培养（ ＭＬＴＣｓ） 后，通过测定淋巴细胞增殖指数（ ＭＴＴ 法） 和ＣＴＬ 杀伤活性（ＬＤＨ 释放改良法） 检测肿瘤细胞的免疫原性。结果：ＣＤ８０ 基因转染的Ｂ１６ 细胞中存在ＣＤ８０ 的稳定表达；与野生型Ｂ１６ 细胞和模拟转染的Ｂ１６ 细胞比较，ＣＤ８０ 转染的Ｂ１６ 细胞体外生长速度无明显变化（ Ｐ ＞ ０－０５） ，体内生长速度明显减慢（ Ｐ＜ ０－０５） ，体外刺激淋巴细胞增殖和诱导ＣＴＬｓ 的能力明显增强（ Ｐ＜ ０－０５） 。结论：弱免疫原性肿瘤细胞导入ＣＤ８０ 基因可增强免疫原性，其作用强弱与肿瘤细胞表达ＭＨＣ 及ＩＣＡＭ１ 等分子的状况有关。

抗人CD80单链抗体对不同肿瘤细胞膜型CD80分子的识别与体外增殖的影响

目的:制备真核细胞CHO表达的CD80单链抗体(CD80-scFv)并研究其对不同肿瘤细胞膜型分子的识别及增殖的影响。方法:将表达CD80-scFv的CHO细胞大规模无血清培养收集上清,采用IMAC亲和层析法纯化获取抗人抗体。采用免疫荧光及流式细胞术分析其对人恶性B系淋巴瘤细胞株Daudi、人黑色素瘤细胞株A375、神经胶质瘤细胞株U251及人多发性骨髓瘤细胞株8266及U266细胞膜型CD80分子的识别。在上述肿瘤细胞的培养体系中加入不同浓度的CD80-scFv,MTT法分析其对肿瘤细胞增殖的影响。以天然高表达CD80分子的8266细胞经丝裂霉素处理后作为APC,人PBMC作为效应细胞,分析抗体通过阻断共刺激信号对PBMC增殖的影响。结果:从CHO细胞培养上清中获取的抗人CD80-scFv纯化品的量为6.67 mg/L;该抗体与Daudi、U251、A375、8266及U266的阳性结合率分别为96.8%、39.6%、20.5%、99.9%及3.8%。抗体对高表达CD80分子的Daudi及8266细胞具有增殖抑制作用,加入抗体(终浓度为25μg/mL)培养72 h时的抑制率分别为24.04%及24.16%。同时,抗体通过阻断CD80-CD28介导的共刺激信号,抑制PBMC的增殖。结论:CD80-scFv能够特异识别细胞膜型CD80分子,并对高表达细胞的体外增殖具有抑制作用。