荔枝CDPK基因家族鉴定及其在霜疫病胁迫下的表达分析

【目的】鉴定荔枝(Litchi chinensis Sonn.)钙依赖蛋白激酶(CDPK)基因家族,并分析其在不同组织和荔枝霜疫病胁迫下的表达模式。【方法】基于荔枝基因组数据,利用生物信息学方法鉴定CDPK家族基因,并对其序列特征、基因结构、启动子顺式作用元件、染色体定位和进化关系等进行分析。依赖276份荔枝种质材料,筛选高抗霜疫病的优良荔枝品种。另外,通过RNA-Seq和qRT-PCR方法检测高抗病荔枝品种中LcCDPK基因家族成员在荔枝霜疫病胁迫处理下的表达模式。【结果】从276份荔枝自然群体材料中鉴定到荔枝高抗霜疫病品种裕荣1号(YR1)。从荔枝基因组中共鉴定出19个LcCDPK基因家族成员,分布于11条染色体上。根据保守结构域和系统发育分析将其分为4个亚家族。基因结构分析表明,LcCDPKs外显子数量为7~19。蛋白结构分析发现,所有LcCDPK蛋白均具有1~4个EF-hand结构域。顺式作用元件分析表明,LcCDPKs成员拥有大量的生物和非生物胁迫响应元件。组织表达分析发现,LcCDPK基因在荔枝不同组织存在组织特异性。另外,表达分析发现在高抗霜疫病荔枝裕荣1号(YR1)中,LcCDPK5、LcCDPK17和LcCDPK19在霜疫病胁迫后急剧上调表达,LcCDPK3和LcCDPK8急剧下调表达。【结论】裕荣1号(YR1)是一种高抗霜疫病的荔枝品种。荔枝基因组中共鉴定出19个CDPK基因家族成员,具有明显的组织特异性,LcCDPK5、LcCDPK17、LcCDPK19、LcCDPK3和LcCDPK8可能在荔枝抗霜疫病过程中发挥重要作用。研究结果为进一步探究荔枝CDPK基因家族提供了参考。

核桃CDPK基因家族鉴定与转录表达分析

钙依赖型蛋白激酶(CDPK)在植物响应逆境胁迫过程中起着重要作用,本研究在核桃全基因组数据库中利用隐马尔可夫模型鉴定CDPK家族成员基因,对该家族成员进行了结构分析,并对冷胁迫和不同组织的转录水平进行分析。结果显示,核桃CDPK基因家族包含38个成员,开放阅读框为399~2181 bp,蛋白大小为132~645个氨基酸,等电点为5.34~9.14,亚细胞定位预测该38个基因均定位于细胞核。在清香核桃冷胁迫不同时间后进行转录表达分析,发现JrCDPK4呈现显著上升趋势,并在根和嫩叶中表达较高,推测该基因可能参与响应冷胁迫以及根、嫩叶的生长发育,本研究结果为进一步研究该基因响应冷胁迫的机理奠定了基础。

玉米ZmRBOHD1和ZmCDPK32的蛋白相互作用研究

为探索玉米呼吸爆发氧化酶(RBOH)与钙依赖型蛋白激酶(CDPK)协同调控花粉管极性生长的机制,通过蛋白保守结构域分析获得14个ZmRBOH家族基因,且利用转录组数据分析了ZmRBOH的时空表达模式.结果显示,ZmRBOHD1和ZmRBOHD2在玉米成熟花粉中特异表达.选择花粉特异表达的ZmRBOHD1和功能已知的花粉管极性生长调节因子ZmCDPK32开展蛋白相互作用研究,结论有如下2点:1)通过瞬时表达ZmRBOHD1-GFP融合蛋白证明ZmRBOHD1定位于细胞膜;2)利用酵母双杂交和双分子荧光互补技术证实ZmRBOHD1可以和ZmCDPK32相互作用,并且生物信息学分析发现ZmRBOHD1具有潜在的CDPK磷酸化靶点.结果表明,ZmCDPK32可能通过与ZmRBOHD1的相互作用协同调控玉米花粉管发育,这为深入探究花粉管极性生长的分子机制奠定了基础.

红花CDPK基因家族的鉴定及表达分析

钙依赖性蛋白激酶(CDPK)是植物细胞内Ca2+信号识别及转导的重要媒介,在植物的生长发育以及逆境响应过程中起着重要的作用。本研究通过多种生物信息学的方法和手段,对鉴定出来的30个CDPK基因进行分析鉴定,结果显示30个CtCDPK基因所编码的氨基酸分子量为47781.96~93251.66 ku,等电点为5.09~9.27;基因结构预测结果表明,所有CtCDPK基因均含有6~13个外显子;染色体定位结果表明,30个CtCDPK基因分别定位在10条染色体上,其中8号染色体上最多,有5个,2号、4号染色体上没有;系统发育树分析结果显示将其分为6个亚家族;表达分析结果表明CtCDPK基因在不同组织、不同发育阶段中表达模式有所差异。

陆地棉钙依赖蛋白激酶GhCDPK28-A10参与抗黄萎病的功能分析

【目的】解析GhCDPK28-A10在棉花黄萎病反应中的作用机制,并为棉花抗病育种提供基因资源。【方法】从棉花基因组数据库获得Gh CDPK28-A10基因同源序列,进行生物信息学分析。采用实时荧光定量聚合酶链式反应(real-time quantitative polymerase chain reaction,qRT-PCR)方法检测在经大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)、茉莉酸甲酯(methyl jasminate,MeJA)、水杨酸(salicylic acid,SA)或H_(2)O_(2)处理的棉株中GhCDPK28-A10基因的表达量变化。通过病毒诱导的基因沉默(virus-induced gene silencing,VIGS)技术验证GhCDPK28-A10在棉花抗黄萎病中的作用。【结果】进化树和基因结构分析表明,陆地棉中GhCDPK28-A10的6个同源蛋白具有相似数量的基序和CDPK家族典型的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶结构域;启动子区域的序列分析发现GhCDPK28-A10包含响应茉莉酸(jasmonic acid,JA)的顺式作用元件。组织特异性表达分析表明GhCDPK28-A10在根、茎和真叶中均表达,且在真叶中表达水平最高。在大丽轮枝菌、MeJA和H_(2)O_(2)胁迫下,GhCDPK28-A10的表达量显著升高。VIGS沉默Gh CDPK28-A10的棉株中抗病相关基因PR1、NPR1、PR4表达增强;JA合成负调控基因JAZ1表达量降低,说明随着CDPK28-A10表达水平的降低,JAZ1对JA合成的抑制作用减弱,活性氧富集,进而增强棉株的黄萎病抗性。【结论】GhCDPK28-A10通过调控防御相关基因的表达,负向调控棉花对黄萎病的抗性反应,是提高棉花黄萎病抗性的候选基因。

二穗短柄草钙依赖型蛋白激酶BdCDPK4基因的克隆及其编码蛋白质的生物信息学分析

二穗短柄草(Brachypodium distachyon L.)因与小麦、大麦等有很高的同源性,作为新型禾本科模式生物吸引了越来越多的研究者。试验采用基因克隆技术分离了二穗短柄草Bd CDPK4基因的编码区序列,并采用生物信息学方法分析了该基因及其编码的蛋白质的序列特征、结构和功能。结果表明,分离了BdCDPK4基因1 851 bp的cDNA序列(Gen Bank登录号为XM_003559516),编码区长度为1 752 bp,编码583个氨基酸,分子量为64.78 ku,等电点为9.12,含有N端可变区、蛋白激酶区、自抑制区、EF手型结构、类似钙调素等结构域。亚细胞定位预测位于叶绿体和液泡上。进化树分析结果显示,该蛋白与小麦Ta CDPK19蛋白的同源性最近。根据各物种间CDPKs蛋白的高同源性,结合小麦TaCDPK19基因被高盐和小麦白粉病菌Blumeria graministritici(Bgt)诱导,推测Bd CDPK4基因也可能参与逆境胁迫下的信号传导途径,在抗逆等生物学过程中发挥重要功能。

普通烟草CDPK基因家族的克隆及表达分析

【目的】从普通烟草中分离更多CDPK基因,分析该基因家族的序列特征、进化关系和表达谱,为全面揭示其功能奠定基础。【方法】采用RT-PCR、RACE和生物信息学的方法,分离普通烟草CDPK基因;采用MEGA4.0软件构建系统进化树;利用RT-PCR研究普通烟草全长基因的表达谱。【结果】分离到普通烟草CDPK基因8个,其中3个可以找到完整的开放读码框;系统进化树分析显示,烟草属11个全长CDPK基因位于4个亚家族,预测的2对普通烟草和拟南芥的直系同源基因在功能上可能非常保守;3个普通烟草全长基因虽然在所有的组织中都能检测到,但是它们的表达谱在不同的组织间存在明显差异。【结论】分离到8个未报道的普通烟草CDPK基因,结合已有的报道,目前在普通烟草中获得了15个CDPK基因,为在基因组范围内研究普通烟草CDPK基因家族的功能奠定了基础。

盐藻CDPK基因的克隆与生物信息学分析

为了研究CDPK基因的结构和功能,应用RT-PCR和RACE方法从盐藻Dunaliella salina中克隆得到CDPK基因(GenBank登录号为JQ964113),并对其进行生物信息学分析。结果表明:盐藻CDPK基因的cDNA全长3 052bp。5'-UTR长70bp;开放阅读框长1650bp,编码549个氨基酸;3'-UTR长1332bp。蛋白表现为弱酸性,且稳定、亲水,二级结构中以无规则卷曲和α-螺旋为主,三级结构同源建模成功。亚细胞定位于叶绿体和细胞核中,无跨膜结构域,无信号肽。蛋白序列中存在4个丝氨酸磷酸化位点、4个苏氨酸磷酸化位点和3个酪氨酸磷酸化位点,蛋白激酶结构域在53～331位氨基酸处,蛋白激酶ATP结合域在59～82位氨基酸处,丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶活性域在173～185位氨基酸处,4个EF-hand钙结合域分别在357～385、393～421、429～457、465～493位氨基酸处。进化分析结果表明,克隆的CDPK基因与团藻、衣藻、盐藻Dunaliella tertiolecta的CDPK亲缘关系最近。为进一步研究CDPK基因的功能及探究盐藻耐盐机制的信号转导途径奠定了分子基础。

梨CDPK基因家族全基因组序列鉴定分析

CDPK是植物特有的一类丝氨酸/苏氨酸型蛋白激酶，在介导植物生育信号和逆境信号转导中具有重要作用。为揭示CDPK基因在梨生长发育与抗逆防御机制中的作用，本研究通过生物信息学手段，结合梨基因组注释信息，鉴定梨基因组中CDPK家族基因成员，利用MEGA6.0程序进行多序列比对、分类并构建系统进化树；利用per1程序以及GSDS工具进行基因结构与保守性分析，为植物CDPK基因功能分析与利用提供依据。结果表明，本研究成功鉴定出26个CDPK家族成员，根据系统发育树分析，所有PbCDPK被分为4类；基因结构预测结果表明，大多数PbCDPK均含有6～7个内含子；且预测的PbCDPK氨基酸序列绝大多数含4个EF-hand功能域；为了深入分析梨与其他物种的同源进化关系，构建了梨与拟南芥、水稻的CDPK基因系统进化树，进化树聚类分析结果将所有的CDPK蛋白分为四类。综上所述，目前已初步获得26个梨CDPK基因，为在基因组范围内研究CDPK基因在梨生长发育与逆境响应中的功能奠定了基础。

杨树CDPK基因家族的表达分析及功能预测

为探究CDPK基因在木材形成过程中的作用,本研究在基因组水平上对杨树CDPKs基因家族的成员进行分析,找到32个CDPKs及10个CRKs成员。对CDPK基因家族成员在杨树中表达特性进行了分析,发现其家族成员在不同组织、不同发育阶段以及毛白杨次生维管发育不同时期的表达特性不同。分析杨树CDPK基因家族中3个基因Pt CPK1、Pt CPK6、Pt CPK15,其蛋白质一级结构均存在1个跨膜区,其蛋白定位在细胞膜上。

梨树CDPK基因家族进化和表达分析

钙依赖蛋白激酶(CDPK或CPK)在植物生长和发育、逆境信号刺激及其对病原物的防御反应过程中发挥着非常重要的作用。本研究利用梨树全基因组数据,采用生物信息学的方法,在全基因组水平上对梨树CDPK基因家族进行系谱进化关系、基因结构、共线性关系及表达情况等分析。结果表明,梨树基因组中共存在31个CDPK基因,命名为PbCDPK1~PbCDPK31。系谱分析结果表明,这些CDPK基因归属于4个亚家族。共线性分析检测到12对CDKP基因间存在显著的共线性关系,其中10对由最近一次发生的全基因组复制事件形成。非同义/同义置换率的比率(dN/dS)说明CDPK基因在功能上进化得非常保守。荧光定量PCR结果发现,5个梨树CDPK基因对干旱逆境有响应。试验结果可为进一步开展梨树CDPK基因家族的功能鉴定和分子进化机制的研究提供参考。

植物中的钙依赖蛋白激酶(CDPK)的结构特征和功能研究进展

Ca2+是植物中重要的第二信使,细胞中的钙信号经钙传感蛋白(CaMs、CaMLs、CBLs和CDPKs)传递到下游组分(转录因子,NADPH氧化酶基因等),引起相关基因的表达,使植物对生物或非生物胁迫作出响应。钙依赖蛋白激酶(CDPKs)是在植物及原生动物中发现的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,在Ca2+介导的信号途径中起重要作用。CDPKs是由多基因家族编码,分属4个亚家族,各亚族成员具有相同或不同的表达模式、亚细胞定位、底物特异性、功能各异或冗余等特性。综述CDPKs的结构特征、表达模式、定位、调控、体内外底物、抑制剂,以及在响应生物及非生物胁迫中的作用等方面的研究进展,旨在探讨CDPKs的功能及其调控机制。

普通烟草钙依赖蛋白激酶NtCDPK15的基因克隆及表达分析

钙依赖蛋白激酶(CDPK)对Ca2+信号转导通路下游元件的调控具有重要作用。本实验采用同源克隆技术从普通烟草中分离得到1个CDPK基因,命名为NtCDPK15(GenBank登录号为JN662020),cDNA全长为1963 bp,ORF大小为1569 bp,编码522个氨基酸。多序列比对结果表明,NtCDPK15的编码产物具有典型的CDPK保守序列,C末端调控区有4个EF手性结构。系统进化树分析显示,NtCDPK15可能来源于绒毛状烟草,预测NtCDPK15与NtCDPK1这对旁系同源基因在功能上可能非常保守。实时荧光定量PCR分析结果表明,NtCDPK15在根和叶中的表达量显著高于茎中的表达量,但经盐胁迫诱导后NtCDPK15在茎中的表达量显著增加,同时,盐胁迫还使基因在叶中的表达量显著上调,ABA胁迫可诱导基因在根中的表达,而干旱胁迫可使基因在根和叶中的表达量下调,这些结果说明NtCDPK15在普通烟草中的表达受盐胁迫及ABA胁迫诱导,但受干旱胁迫抑制。

植物中钙依赖蛋白激酶(CDPK)的研究进展

Ca^(2+)是植物细胞信号转导中重要的第二信使,在植株受到外界逆境胁迫时,细胞中的钙信号经钙传感蛋白(CaMs、CaMLs、CBLs和CDPKs)传递到下游组分引起相关基因的表达,从而响应环境的各种变化。钙依赖性蛋白激酶(CDPK)是Ca^(2+)传感器,可以将细胞内Ca^(2+)信号传递到可以与14-3-3蛋白相互作用的靶蛋白从而刺激靶蛋白发生磷酸化。CDPK在植物生长的诸多方面发挥关键作用,如花粉管的伸长、植物的生长发育以及对生物胁迫、非生物胁迫的应激反应。大多数CDPK具有明显的亚细胞分布,使它们能够"感受"局部Ca^(2+)浓度的变化并与其靶细胞发生特异性作用。14-3-3蛋白是一类通过磷酸化激活的真核蛋白,它可以与不同靶蛋白相互作用,调控植物重要的生理生化过程。近年来研究发现,14-3-3蛋白作为CDPK的靶蛋白和CDPK交叉磷酸化形成CDPK/14-3-3复合物,进一步调节植物初级代谢、开花和激素合成。将从CDPK的结构、亚细胞定位、靶蛋白、生物学功能,特别是CDPK与14-3-3之间的交叉调节及其在植物信号通路中的协同作用方面进行全面的综述,旨在为未来CDPK研究提供参考和新的方向。

野生大豆CDPK基因保守区的克隆及序列分析

CDPK(Ca2+-dependent,calmodulinindependentproteinkinase)是植物钙信号传导过程中关键的蛋白激酶,在逆境胁迫信号传导过程中起到重要作用。研究基于同源序列候选基因的策略,根据已经公布的多个CDPK序列的比对结果,在保守性较高的区域,设计两对巢式简并引物,结合降落PCR和巢式PCR在野生大豆中克隆。对获得的序列片段进行序列分析,发现该序列具有激酶活性的功能区域和CDPK特有的EF手性结构区,并且与VrCDPK(U08140)序列达到94%的相似性,可以确定该片段是CDPK基因的保守序列。结果证明,野生大豆中也存在CDPK基因,并为通过RACE等方法获得野生大豆全长CDPK基因奠定了基础。

钙依赖蛋白激酶(CDPKs)在植物钙信号转导中的作用

CDPKs在植物钙信号转导中起重要作用。本文介绍了植物钙信号转导及CDPKs的结构与生化性质 ,在此基础上 ,重点总结了CDPKs在植物钙信号转导中的潜在调节作用 ,包括基因表达、代谢、离子和水分的跨膜运输、细胞骨架的动态变化、气孔运动和生长发育等 。

龙血树DCDPK2基因的克隆及表达分析

通过RACE技术克隆龙血树CDPK基因的全长cDNA,并对基因序列进行相关分析与基因表达分析。结果表明:该基因全长为1 810 bp,编码区长度为1 587 bp,编码528个氨基酸,其氨基酸序列具有CDPK基因编码氨基酸的所有典型结构特征;经序列比对发现其核酸序列与玉米CDPK基因的同源性高达81%,氨基酸序列与其它植物中的CDPK氨基酸序列同源性很高。该基因命名为DCDPK2基因。对未经血竭诱导和诱导的龙血树组培苗进行半定量RT-PCR表达分析,发现在添加了诱导物的组培苗中DCDPK2基因的表达显著增强。

钙依赖型蛋白激酶(CDPKs)在植物中的生理功能

简要介绍了钙依赖型蛋白激酶(Calcium-dependentProteinKinases,CDPKs)的结构特点及家族成员,重点对CDPKs在植物环境胁迫、防御反应、生长发育、离子通道调节和激素信号等方面的生理功能研究进展进行了综述和讨论,并展望了该领域的研究前景。

羊草CDPK基因全长cDNA的克隆及原核表达

【目的】通过对羊草Leymus chinensis CDPK基因进行克隆及原核表达,为进一步研究CDPK基因的功能,探讨羊草适应生境分子机制提供理论基础.【方法】用RT-PCR结合RACE技术克隆了羊草钙依赖蛋白激酶（CDPK）基因,命名为Lc-CDPK;构建了羊草CDPK基因的原核表达载体,转化到大肠埃希菌Escherichia coli BL21（DE3）,异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）诱导后,经SDS-PAGE分析CDPK蛋白的表达情况.【结果和结论】羊草CDPK基因全长c DNA序列为1 704 bp,包括1个1 647 bp的开放阅读框,编码548个氨基酸,从第81~339个氨基酸构成了具有丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶催化活性的S-TKc结构域,有4个保守的EF手型结构域;编码区核苷酸序列与其他禾本科作物比对后发现,与小麦CDPK基因的相似性最高,相似度为96%;IPTG诱导表达出相对分子质量为61 350的融合蛋白,表达产物大小与预计理论值相符.诱导7 h蛋白表达量最高,表达量占菌体总蛋白的49.1%.

小桐子CDPK及相关激酶基因家族的全基因组鉴定及表达分析

基于小桐子基因组数据库,在全基因组水平对小桐子CDPK及相关激酶基因家族进行鉴定,并对其系统进化、基因结构、保守结构域、染色体定位以及器官与低温胁迫表达进行分析,为深入开展小桐子CDPK及相关激酶基因的功能鉴定及其在小桐子遗传改良中的应用提供依据。利用CDPK结构域的隐马尔可夫模型对小桐子蛋白质数据库进行相似性检索,经过Pfam与CDD在线工具的验证获得小桐子CDPK及相关激酶基因家族成员。利用不同的工具对CDPK及相关激酶基因进行生物信息学对比分析。通过小桐子器官与低温表达谱数据进行CDPK及相关激酶基因的表达分析。小桐子基因组中共检索到17个CDPK基因、5个CRK基因、2个PPCK基因、4个PEPRK基因以及1个CCaMK基因,各基因家族成员的基因长度、蛋白质等电点及亚细胞定位等理化参数具有家族特异性。序列比对与系统进化分析显示,5个基因家族都单独聚类,而CDPK与PEPRK基因家族又分别聚类为4个与2个亚族,且鉴定到小桐子CDPK家族成员的N-端可变区、激酶结构区、自抑区及EF-hand调控区4个保守结构域以及其他激酶成员的激酶结构域。同时,分别有21个与24个CDPK及相关激酶可能发生N-豆蔻酰化与N-十六烷酰化的修饰。染色体定位表明,小桐子CDPK及相关激酶基因不均匀地分布于10条染色体上,且存在JcCDPK7/JcCDPK9串联复制现象。转录组表达分析表明,29个CDPK及相关激酶基因中,有24个基因在叶片、根及种子中都有表达,而JcCDPK3、JcCDPK11、JcCRK3及JcCCaMK属于低温诱导高表达基因,与小桐子的抗冷性直接相关。