利用基因扫描分析TCR Vβ亚家族的CDR3长度方法检测T细胞克隆性

分析了健康人、Ｔ－ＡＬＬ外周血及Ｔ细胞株Ｍｏｌｔ－４和Ｊｕｒｋａｔ中ＴＣＲＶβＴ细胞的表达和克隆性。应用ＲＴ－ＰＣＲ扩增ＴＣＲＶβ２４个亚家族的ＣＤＲ３，并经基因扫描和序列分析确定Ｔ细胞克隆性。结果表明健康人表达除Ｖβ２０外的多克隆Ｔ细胞；Ｔ－ＡＬＬ仅表达３～４个Ｖβ亚家族Ｔ细胞；部分呈寡克隆性；Ｍｏｌｔ－４和Ｊｕｒｋａｔ分别表达Ｖβ２和Ｖβ８单克隆Ｔ细胞。Ｔ－ＡＬＬ中存在克隆性生长Ｔ细胞。该方法是检测Ｔ细胞克隆性的敏感和精确的方法。

活动性肺结核患者α/βTCR基因重排及CDR3谱型分析

目的:建立多重PCR方法扩增α/βTCR全长序列,分析活动性肺结核患者病变局部T淋巴细胞α/βTCR基因重排特点及CDR3谱型。方法:分离结核患者肺泡灌洗液中的淋巴细胞,提取RNA后用SMART方法逆转录,运用根据现有文献设计的α和βTCR扩增引物,进行多重PCR扩增以获得其全长序列,构建重组质粒并测序,利用DNAstar及网上TCR资源分析序列。结果:3例患者共获得24个α链序列,13个β链序列。α链以AV1S2(54%)、AV12S3(41%)、AV12S2(5%)为主;β链以BV2(38%)、BV29S1(46%)、BV14(3%)、BV4S2(3%)为主。同一病例及不同病例之间CDR3区呈现多样性,但是标本1、标本3各有一条β链的CDR3氨基酸序列相同:SVGTGTLHQETQY;标本2和标本3的各有2条α链CDR3序列相同:AVRDWAGNMLT;标本2的一个α链和标本3的一个α链的CDR3均有:AV…DNN…RLM序列。结论:建立了TCRα和β链全长序列的多重PCR扩增方法。结核患者病变局部克隆性增殖的TCRα和β链谱型呈限制性取用,克隆增生的T淋巴细胞来自不同的亚群,但是相同的CDR3序列对于识别MTB多肽可能具有特异性。

内毒素耐受状态下胸腺细胞TCRβ链CDR3区多态性和长度的变化

目的研究内毒素耐受状态下小鼠胸腺T细胞TCRβ链CDR3多态性和长度的变化,并探讨其意义。方法以5mg/kg浓度LPS腹腔注射C57BL/6小鼠建立内毒素耐受模型,5 mg/kg浓度生理盐水腹腔注射72 h后为对照组,提取对照组、模型后72 h实验组和8 d实验组的小鼠胸腺组织RNA,并逆转录为c DNA;以22条TRBV基因家族序列设计上游引物,TRBJ1-1基因家族序列设计下游引物,PCR扩增出完整的TCRβ链CDR3区;毛细管电泳技术分析TCRβ链CDR3区的多态性和长度。结果正常小鼠胸腺样本多数呈现中间高两边低的正态性分布的TCRβ链CDR3谱型峰图,少数呈现偏峰、寡峰或低峰;LPS注射后72 h胸腺样本TCRβ链CDR3区呈现数量不等的偏峰、寡峰和低峰;模型8 d胸腺样本大多呈现多峰。此外,与正常组相比,模型72 h和8 d胸腺样本TCRβ链CDR3区产物长度均发生了不同程度的变化。结论内毒素耐受状态下,小鼠胸腺细胞TCRβ链CDR3区的多态性和长度均发生了明显改变,为后续进一步研究该状态下胸腺细胞发育及功能变化提供前期实验基础。

采用荧光定量PCR溶解曲线法监测人TCR alpha链CDR3谱系漂移技术的初步探讨

目的:初步探讨荧光定量PCR溶解曲线分析技术监测人外周血T细胞TCRalpha链CDR3谱系漂移(单/寡/多克隆增生)。方法:提取4例正常人、2例淋巴瘤型白血病患者PBMC中的总RNA,逆转录成cDNA,以32个人TCRalpha链胚系可变区基因家族(TRAV)设计上游引物,共同的TCRalpha胚系链恒定区基因家族(TRAC)设计下游引物,荧光定量PCR(FQ-PCR)扩增32个TRAV基因各家族CDR3谱系,溶解曲线法分析各家族CDR3谱系的单/寡/多克隆增生。结果:正常人外周血T细胞TCRalpha链32个家族CDR3表达频率不一致,各家族PCR产物的溶解曲线谱型图(melting curve spectratyping)呈现熔点不同的CDR3多态性,为多克隆增生的高斯分布,2例淋巴瘤型白血病患者外周血T细胞TCRalpha链32个家族CDR3表达频率不一致,部分家族呈缺失状态,患者各家族PCR产物的溶解曲线谱型图上,多数家族为多克隆增生的高斯分布,但每个患者均出现数量不等的单克隆和寡克隆增生家族。结论:荧光定量PCR溶解曲线分析TCRalpha链CDR3谱系漂移技术方法稳定简便,能较好地监测正常人和临床样本外周血T细胞TCRalpha链CDR3谱系漂移(单/寡/多克隆增生)。

MSM HIV感染者特异性T细胞TCR α CDR3谱序初探

目的监测HIV感染者的外周血样本TCRα链CDR3谱系变化,发现HIV特异性TCR TRAV家族。方法用本实验室已建立的"荧光定量PCR溶解曲线法监测HIV感染者TCR CDR3谱系漂移技术",对22名健康男性、19名MSM HIV感染者的外周血样本TCRα链CDR3变化进行监测。结果MSM HIV感染者的TRAV4.2,TARV10和TRAV23的单(寡)性表达频率要高于健康男性人群(P<0.05),MSM HIV感染者的TRAV亚家族的缺失率(1.70%)虽然高于对照男性健康人群的TRAV亚家族的缺失率(0.80%),但二者没有统计学差异。结论在国内首次利用"荧光定量PCR溶解曲线法"监测HIV感染者TCRα链CDR3漂移变化,发现MSM HIV感染者的TCR AV家族存在单(寡)性增生和缺失现象,非正态分布现象增加,多样性减少。

高通量测序分析脓毒症患者早期T细胞抗原受体β链CDR3的组成及多态性

目的 采用高通量测序的方法探讨脓毒症患者早期T细胞抗原受体（TCR）β链互补决定区3（CDR3）的组成及多态性。 方法 从深圳市人民医院重症医学科收集脓毒症患者6例，从体检科收集年龄匹配的对照患者9例，入科后留取其静脉血，分离外周血单核细胞并提取DNA，对TCR β链CDR3进行多重PCR扩增，然后对产物进行高通量测序及数据分析。 结果 脓毒症组（S组）和对照组（N组）的TCR β链CDR3长度呈高斯分布，且两组前60种特有核苷酸序列和特有氨基酸表达水平存在很大差异；针对TRβV片段59个基因的表达水平进行比较，其中TRBV 10-2、TRBV 10-3、TRBV 12-1、TRBV 5-7的表达水平差异有统计学意义（P＜0.05）；对TRβJ片段中的14个基因的表达水平进行了F检验，其中TRBJ 1-1、TRBJ 1-2、TRBJ 2-1、TRBJ 2-5的表达水平差异有统计学意义（P＜0.05）。 结论 脓毒症患者早期T细胞TCR β链CDR3的多态性发生了明显改变，提示其与脓毒症的免疫发病机制有关，这将为脓毒症的发病机制研究、治疗和预后的判断提供新的方法和手段。

抗原特异TCR α和β链基因克隆及分子空间结构预测

目的扩增弥漫大B细胞淋巴瘤(diffuse large B cell lymphoma,DLBCL)相关抗原特异T细胞克隆的全长TCRα和β链基因序列,并对其三维空间结构进行预测。方法从已鉴定的2例伴有克隆性增殖TCR Vα6和Vβ13亚家族T细胞的DLBCL患者外周血中克隆全长TCRα和β基因序列,利用Primer Premier 5.0分析软件推算其相应的氨基酸序列,并通过自动化蛋白质模建服务器SWISS-MODEL进行三维空间结构预测。然后利用蛋白质三维图像分析软件Rasmol对所获得的TCR三维空间结构进行显示和分析。结果获得DLBCL相关抗原特异TCRα6和β13全长基因序列及其氨基酸序列。2例患者的TCR Vα6的空间结构与PDB ID:3ffcD模型相似,序列同源性分别为92.16%和91.71%;而2个TCR Vβ13也均具有同一个空间结构模型PDB ID:2ialD,序列同源性分别为92.95%和92.18%。结论来自不同DLBCL患者外周血中克隆性增殖的TCR Vα6或Vβ13亚家族T细胞的TCR具有高度同源性的空间结构,提示其可能识别相同的肿瘤抗原表位。

用TCRβ可变区基因阵列反映疾病的淋巴细胞克隆变化

将正常脐带血TCRβ(T细胞受体 β)重排基因制备成基因阵列 ,观察能否反映肿瘤或自身免疫病患者的淋巴细胞克隆的变化。方法 采用RT -PCR扩增混合 1 0例脐带血的cDNA不同家族的TCRβ可变区基因全部序列 ,经测序胶或SS CP电泳后 ,电转移到尼龙膜上 ,制成TCRβ可变区基因阵列。用同位素α - 32 PdCTP标记正常成人、脐带血、待检患考的TCRβ基因 ,与基因阵列杂交。结果 :从测序胶排列的基基阵列发现 ,正常成人及脐带血呈正常高斯分布 ,即呈多克隆性 ;一些肿瘤患者T淋巴细胞克隆有少数几个克隆的异常增生 ,即呈寡克隆性 ;1例急性T淋巴细胞白血病患者仅在Vβ1 6见单一的条带扩增 ,呈单克隆性。结论 :该基因阵列可以反映正常人淋巴细胞的克隆分布和疾病时出现的淋巴细胞变化。

非小细胞肺癌患者T细胞受体Vβ表达和克隆性研究

目的 了解非小细胞肺癌 (non small celllungcancer ,NSCLC)患者外周血淋巴细胞 (PBL)、肿瘤浸润淋巴细胞 (TIL)及非癌肺组织淋巴细胞中T细胞受体 (TCR)Vβ优势表达情况及优势亚家族的克隆性分布。方法 收集 2 4例NSCLC患者外周血、肺癌组织和非癌肺组织 ,提取RNA ,经反转录多聚酶链反应 (RT PCR) ,扩增TCRVβ 2 4个亚家族基因的互补决定区 3(CDR3) ,PCR产物进一步经基因扫描分析 ,以 10例正常人外周血结果作对照 ,比较不同来源T细胞TCRVβ亚家族的表达情况。 结果 NSCLC患者仅存在部分亚家族的T细胞 ,其中TCRVβ5的表达率在TIL中 (6/18,33.3% )明显高于PBL(1/2 4,4.2 % )和非癌肺组织(0 /12 ) ,P值均 <0 .0 5 ,而且 6例表达Vβ5的TIL中 2例为寡克隆增殖 ,4例为多克隆增殖。 结论 NSCLC患者TCRVβ 2 4个亚家族呈倾斜性分布和克隆性增殖 ,提示NSCLC的TIL中可能存在肿瘤相关抗原 (TAA)

慢性乙型肝炎患者外周血CD8^+T细胞TCR Vβ基因亚家族克隆化的研究

目的:分析慢性乙型肝炎(CHB)患者CD8+T细胞TCR Vβ基因亚家族克隆化特征。方法:采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)扩增8例CHB患者外周血CD8+T细胞TCR Vβ基因22个亚家族的CDR3区,基因扫描技术对TCR Vβ亚家族的克隆化进行鉴定。结果:基因扫描显示所有8例CHB患者CD8+T细胞TCR Vβ基因亚家族均出现一个或一个以上单克隆或寡克隆增生。Vβ8、Vβ11、Vβ12出现单克隆增生的频率相对较高。8例健康者TCR Vβ基因亚家族均为多克隆。结论:CHB患者外周血CD8+T细胞TCR Vβ亚家族存在克隆性增生。

对T细胞受体克隆型肽类的免疫应答(英文)

目的：皮肤Ｔ细胞淋巴瘤（ＣＴＣＬ）是记忆性诱导Ｔ细胞肿瘤，表达独特的Ｔ细胞受体（ＴＣＲ）的α和β链，两者各含有克隆性独特蛋白序列。这些序列由独特型或第３决定簇互补区（ＣＤＲ３）组成。理论上，来源于ＴＣＲＣＤＲ３的肽类可作为由主要组织相容性复合体（ＭＨＣ）Ⅰ类分子提呈的肿瘤特异抗原。本研究旨在确定细胞毒性Ｔ淋巴细胞（ＣＴＬ）是否识别ＣＤＲ３来源的肽类。方法：首先培育出能裂解２例ＣＴＣＬ病人自身的肿瘤细胞的ＣＴＬ（ＣＤ８＋）细胞株，然后检测这些ＣＴＬ对由原始Ｂ淋巴细胞提呈的源于自身恶性细胞ＴＣＲＣＤＲ３序列的合成肽产生应答的能力。结果：ＣＴＬ分泌肿瘤坏死因子（ＴＮＦα），对自身ＴＣＲβ链独特型肽产生应答，但对来源于其他ＴＣＲβ链独特型区的肽或对照肽不产生应答。抗ＭＨＣⅠ类分子的单克隆抗体（Ｗ６／３２）能阻断其肽的识别。结论：首先表明ＣＴＬ可识别具有ＣＴＣＬ病人个体独特性的恶性淋巴细胞克隆的特异ＭＨＣⅠ类分子相关肽并对其产生应答；又提示起刺激作用的肽来源于ＴＣＲβ链独特型区。该研究建立了这种机制，其他Ｔ细胞可通过此机制调解既定的抗原特异性Ｔ细胞。ＣＴＣＬ的肿瘤特异性表位的鉴定，可能有助开发强化或启动ＣＤ８介导的?

人免疫球蛋白重链可变区基因的特征分析

目的:分析五类免疫球蛋白重链可变区基因的特征.方法:收集IMGT/LIGM-DB数据库中人类五类Ig重链可变区的基因序列,利用IMGT/HighV-QUEST分析其基因取用、V区AA变化、CDR3氨基酸长度和构成以及连接多样性.结果:IgM、IgG和IgE均较多地取用IGHJ4、IGHV1-69和IGHV5-51,且在IgM、IgG、IgA与IgE中可观察到几个相似的优势V-J配对.IgD具有较高的V区突变,主要体现在FR3区的高突变(AA变化值为7.2±2.4),而IgM的每个结构域的突变均明显低于其他类Ig.此外,IgD具有较高P插入发生率和插入核苷酸数明显多于其他四类Ig.结论:本研究从基因特征上描绘了人类五类Ig相互间的相似性与差异性,这些结果可为抗体工程领域提供重要参考数据.

荧光定量PCR熔解曲线分析技术检测MSM HIV感染者T细胞TCR β链CDR3谱序初探

目的监测HIV感染者的外周血样本TCRβ链互补决定区3(CDR3)谱系变化,发现HIV特异性TCR TRBV家族。方法用本实验室已建立的"荧光定量PCR溶解曲线法监测HIV感染者TCR CDR3谱系漂移技术",对22名健康男性、19名MSM HIV感染者的外周血样本TCRβ链CDR3变化进行监测。结果 MSM HIV感染者的TRBV 5.2,TRBV7,TRBV9和TRBV20的单(寡)性表达频率要高于健康男性人群(P<0.05),MSM HIV感染者的TRBV亚家族的缺失率(4.25%)高于对照男性健康人群的TRBV亚家族的缺失率(0.52%)(P<0.05)。结论在国内首次利用"荧光定量PCR溶解曲线法"监测HIV感染者TCRβ链CDR3漂移变化,发现MSM HIV感染者的TCR BV家族存在单(寡)性增生和缺失现象,非正态分布现象增加,多样性减少。

“荧光定量PCR溶解曲线法”监测HIV感染者TCR α链CDR3谱系漂移的研究

目的利用"荧光定量PCR溶解曲线分析技术"监测HIV感染者外周血T细胞TCRα链CDR3谱系漂移(单/寡/多克隆增生)。方法提取6例HIV感染者、4例健康者外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)中的总RNA,逆转录成cDNA,设计人32个TRAV基因家族上、下游引物,荧光定量PCR(FQ-PCR)扩增32个TRAV基因各家族CDR3谱系,溶解曲线法分析各家族CDR3谱系的单/寡/多克隆增生。结果健康者外周血T细胞TCRα链32个家族CDR3表达频率不一致,各家族PCR产物的"溶解曲线谱型图"显示多克隆增生的高斯分布,呈现溶点不同的CDR3多态性,6例HIV感染者的外周血TCRα链CDR3谱系的32个家族CDR3表达频率不一致,患者各家族PCR产物的"溶解曲线谱型图"显示多数家族为多克隆增生的高斯分布,但每个患者均出现数量不等的单克隆和寡克隆增生家族。结论荧光定量PCR溶解曲线法监测人TCRα链CDR3谱系漂移的方法稳定、简便,可以用来监测健康者和HIV感染者外周血T细胞TCRα链CDR3谱系漂移。

自身免疫性疾病患者外周血TCR VβCDR3谱型的特点

目的研究自身免疫性疾病(AID)自体外周血T淋巴细胞受体β链(TCRβ)CDR3基因谱型的表达特点,从而总结AID的发病特征与基因谱型的关系及指导免疫治疗。方法选取2007—2009年成都中医药大学附属医院门诊就诊的AID患者41例作为研究对象,应用逆转录-聚合酶链反应扩增AID患者外周血TCRβ可变区(V)基因系列的25个家族,同时将电泳胶于长泳道测序,呈现TCRVβCDR3基因表达谱型图,通过图中电泳条带明确T淋巴细胞质克隆增生特征,分析其TCRβ基因序列,明确AID谱型的特征及AID发病特点并指导AID的治疗。结果CDR3基因表达谱型图呈现10余条呈高斯分布的电泳带,主要由正常TCRβV25个家族的基因序列电泳后依次形成。41例患者CDR3谱型图均呈现异常克隆增生,其中10例系统性红斑狼疮(SLE)患者克隆增生的家族有βV1~4、5.1、6~9、13.1、13.2、14~18、20、21、23~25等,13例类风湿关节炎(RA)患者克隆增生的家族有βV1~4、5.1、5.2、6~9、12、13.1、13.2、14~16、18、20、21、23、24等,4例强直性脊椎炎(AS)患者克隆增生的家族有βV1~4、6、8、9、11、12、14、15、17、20、24、25等,2例白塞氏病患者克隆增生的家族有βV1、3、5.2、11、13.1、13.2、14、15等,6例CTD患者克隆增生的家族除外βV9、18、21、22、24、25等,2例干燥综合征(SS)患者克隆增生的家族有βV2~4、5.2、6、7、13.1、15~17、20等,3例成人STILL′S病患者克隆增生的家族有βV 3、4、5.1、6、8、9、11、13.1、14、15、20等,1例SS患者克隆增生的家族有βV 1、4、13.1、20等。单一条过度浓集之所以在谱型图上呈现是因患者寡克隆T淋巴细胞增殖或单克隆。1例RA患者Vβ25 CDR3区、Vβ25 CDR3区、Vβ4 CDR3区分别与3例SLE、4例SLE、1例SLE患者完全一致。1例AS、1例SLE患者Vβ1 CDR3区完全一致(CASSEGLGAYEQYF),1例SS、1例SLE患者Vβ20 CDR3区完全一致(CAGSVSGRSNNEQFF)。结论AID患者出现T淋巴细胞克隆增生,同种AID具有相对倾向性的克隆条带,不同AID之间也存在相同的克隆条带,AID分类可能与特异性条带具有直接关系,且针对特异性克隆条带治疗,可能是治疗AID的捷径。