以逆转病毒介导对人脐血CD_(34)^+造血细胞进行人MDR1基因转染的实验研究

探讨逆转录病毒介导的MDR1基因转导入脐血CD34+细胞的最佳方法,为MDR1基因转导的临床应用打基础。方法:用磷酸钙沉淀法将含有人全长MDR1cDNA的逆转录病毒载体pHaMDR1/A转到包装细胞PA317中,建立产病毒细胞系,以人脐血中分离的CD34+造血干/祖细胞为靶细胞,在体外进行基因转染,转导的条件为:与含病毒的上清液共培养12天,每天更换病毒上清液,上清液中加入IL-3,IL-6和SCF三种造血生长因子(HGF),转染后用集落培养法测定对COL的耐药性,用PCR检测14～17天所形成集落的MDR1cDNA,计算转染率,用免疫组化法检测P170的阳性程度,并观察不同时间间隔加HGF对脐血CD34+细胞的扩增和转染的影响。结果:脐血CD34+细胞转染阳性为86.4%,P170的阳性率为77.0%,77.1%的集落对6ng/ml的COL耐受,57.4%的集落对7ng/ml的COL耐受。结论:此转染系统既能有较好的转导效果,也有较好的扩增效果,有一定的临床实用价值。

恶性肿瘤患儿自体外周血CD_(34)^+造血干细胞的动员和检测

目的探讨恶性肿瘤患儿经化疗和细胞因子动员后，外周血CD造血干细胞的含量变化及意义。方法恶性肿瘤患儿6例，经化疗和细胞因子动员后，用CD抗体标记，流式细胞仪检测外周血CD细胞18次，对测定结果进行统计学分析。结果6例患儿的CD细胞的百分率为1．78％～9．72％，较正常儿童外周血的含量增加17～97倍，CFU-GM增加19～74倍。三组不同疾病：NHL、ANLL和ALL之间CD细胞含量有显著性差异，P＜0．01。结论恶性肿瘤患儿经动员后，CD造血干细胞及CFU-GM有明显扩增，CD的检测在自体造血干细胞移植中具有重要的意义。

脐血CD_(34)^+细胞免疫表型的分析

应用免疫磁珠法分离脐血CD细胞，以比较CD细胞亚群及各系相关抗原的变化。经过分离，CD细胞由1．47±0．77％升至57．39±16．17％，分离后CDCD细胞占CD细胞的比率为7．82±4．79％CD。细胞纯化同时可减少CD细胞达14．12±9．18倍，CD细胞减少16．42±21．47倍；B系（CD(19)）、巨核系（CD(41)）、NK系（CD(56)）各抗原表达率在CD细胞分离后均明显降低。结论：CD细胞纯化可明显减少CD细胞，应用纯化的CD细胞进行移植应加强支持治疗。

rhTPO对CD_(34)^+细胞增殖及形成CFU-MK作用的研究

目的研究重组人TPO（rhTPO）单独及与rhIL-3、rhIL－6、rhSCF协同体外对巨核系的增殖效应。方法采用纯化的CD+34细胞，进行求固体巨核细胞集落培养和液体悬浮培养，研究TPO及与IL－3、IL－6、SCF协同体外对CD+34细胞增殖及向巨核系空向分化的特性，和形成CFU－MK的作用。结果rhTPO可以诱导CD+34细胞形成CFU－MK，增加巨核细胞集落数，这种作用可以被rhIL－3、rhIL－6、rhSCF增强。液体培养中，rhTPO促进CD+34变细胞分化／成熟为表达GPⅡb／Ⅱa的细胞，增加体系中CD+34。细胞，rhIL-3、rhIL－6、rhSCF可以协同TPO的作用。结论TPO作为一种促增殖因子，促进巨核系祖细胞的增殖及分化。

低温冷冻对脐血CD_(34)^+细胞和造血祖细胞增殖的影响

采用－８０℃低温冷冻法，观察冷冻前及冷冻后１、２、３周时单个核细胞（ＭＮＣ）的回收率，脐血造血前体细胞在体外的增殖力，并用流式细胞仪检测ＣＤ３４＋细胞的百分率。旨在探讨低温冷冻对脐血造血前体细胞的影响。结果表明：脐血冷冻后１、２、３周时ＭＮＣ的回收率分别为９３．６％，９１．５％和９０．７％（Ｐ＞０．０５）；细胞活力分别为９８％，９７％，９５％和９１％（Ｐ＞０．０５）；ＣＤ３４＋细胞依次为１．２０％、１．１８％、１．１６％和１．１７％；ＣＦＵ－ＧＭ，ＣＦＵ－Ｅ冷冻后１、２周时回收率达９７％和９５％（Ｐ＞０．０５），第３周时达８９％（Ｐ＞０．０５）。结果提示：长期冷冻可能导致冷冻之脐血祖细胞产率下降，但对代表造血干细胞的ＣＤ３４＋细胞影响则不大。

羟基淀粉沉淀对免疫磁珠法分离脐血CD_(34)^+细胞及造血祖细胞增殖功能的影响

目的 :应用羟基淀粉沉淀去除脐血红细胞和免疫磁珠 (MACS)阳性选择 ,建立富集、分离脐血CD34+ 细胞的简易实用方法 ,通过造血祖细胞集落培养分析其在细胞因子作用下的增殖潜能 ,观察羟基淀粉沉淀对造血细胞增殖功能的影响。方法 :采用羟基淀粉沉淀和改进的 MACS富集、分离脐血 CD34+细胞 ,以甲纤半固体造血细胞培养法观察其粒 -单系细胞 (CFU- GM)和红系爆式集落 (BFU- E)的数量和特性。结果 :脐血分离前 ,CD34+细胞纯度为 1.5 %～ 3% ,MACS分离后其纯度可达 85 % ,羟基淀粉沉淀和 MACS分离可达 91% ;CD34+造血祖细胞培养有明显的增殖 ,采用 IL - 3、IL - 6、SCF、GM- CSF、EPO等细胞因子组合扩增培养 9～ 14d,CD34+ 细胞在液体培养中有明显扩增 ,MACS分离后 CD34+ 细胞总数增加 39倍 ,羟基淀粉沉淀和 MACS分离可增加 45倍。结论 :应用羟基淀粉沉淀和改进的 MACS系统可有效富集、分离脐血 CD34+细胞 ,羟基淀粉沉淀对 CD34+细胞的富集、分离无影响 ;脐血细胞分离后作造血祖细胞培养 ,可产生丰富的 CFU- GM和 BFU- E,说明羟基淀粉沉淀分离的 CD34+ 细胞的增殖功能优于 MACS分离 CD34+ 细胞的增殖功能。

脑外伤病人外周血CD_(34)^+细胞及白细胞含量的动态变化

为动态观察并探讨不同损伤程度的颅脑损伤病人外周血白细胞及CD_(34)^+细胞的变化及同预后的关系,以及二者升高的机制和临床意义,选取我院神经外科收治的伤后6h内入院脑外伤病人,按入院时格拉斯哥昏迷评分(Glasgow coma sale,GCS)分为轻重两组,同时选择我院体检中心健康成年人15名,作为对照组。于入院第1天、第3天、第5天、第7天、第11天、第14天抽取静脉血,用流式细胞仪检测外周血CD_(34)^+细胞含量;用血细胞分析仪常规检测白细胞计数,同时观察病情变化,追踪预后,按照病人预后不同情况分成死亡组和生存组,比较分析相关数据。结果表明,30例颅脑损伤病人外周血白细胞及CD_(34)_^+细胞数量随病程的发展均有不同程度的升高,损伤越重、GCS评分越低,白细胞及CD_(34)^+细胞计数越高,预后越差,白细胞升高持续时间越长,预后愈差。外周血CD_(34)^+细胞在颅脑损伤后轻、重两组病人,各时间段逐步升高。重症病人自第3天与正常对照组出现统计学差异,明显高于轻症组病人,轻、重症两组间比较,在第7、11、14天有统计学差异。白细胞计数在伤后迅速升高并逐步下降,同CD_(34)^+细胞变化未见正相关。本研究认为,外周血白细胞及CD_(34)^+细胞,在颅脑损伤病人急性期均有不同程度的升高,计数增高越明显,持续时间越长,结果预后越差。外周血白细胞及CD_(34)^+细胞计数的变化可以成为判断其预后的重要指标。

CD_(34)^+细胞与骨髓增生异常综合征患者生存率的关系

目的 探讨CD34+细胞与骨髓增生异常综合征 (MDS)患者生存率的相关性。方法 应用免疫组化SAP法对 56例MDS患者骨髓细胞CD34抗原进行检测 ,并随访 3～ 5年 ,同时定期门诊复诊及住院治疗。结果 56例中 ,CD34- 3 3例 ,CD34+2 3例 ,随访 3～ 5年后 ,阴性组 10例 ( 3 0 .3 % )转为急性白血病 (AL) ,阳性组 14例 ( 60 .9% )转为AL ,差异有显著性 (P <0 .0 1)。 17例RAEB患者中 ,CD34- 中数生存期 4 7月 ,CD34+者 16月 ,3年生存率前者 69% ,后者 2 1.1% .12例CD34+高表达RAEB T患者中 ,转化成AL时间明显缩短。结论 CD34+患者具有高危转为AL ,CD34+高表达RAEB T短期内转化为AL 。

川芎嗪对免疫介导再生障碍性贫血小鼠骨髓细胞CD_(34)抗原表达的影响

探讨川芎嗪对免疫再生障碍性贫血（再障）小鼠骨髓细胞ＣＤ_（３４）抗原分子表达的影响。方法：建立免疫介导的再障小鼠模型， ６．０Ｇｙ～^（６０）Ｃｏγ－射线照射和尾静脉输注淋巴细胞造成小鼠再障。分为正常组、再障组（对照组）、川芎嗪组，除正常组外均胃饲川芎嗪注射液 ４ｍｇ／次，１天 ２次，第 １０天用流式细胞仪检测各组小鼠骨髓细胞膜上 ＣＤ_（３４）抗原表达量。结果：川芎嗪 ＣＤ_（３４）抗原表达量的荧光强度（７７．６±６．５）明显高于再障组（６８．６±４．５，Ｐ＜０．０５），与正常组（８０．０±２．６）比较无明显差异。结论：川芎嗪通过影响骨髓微环境促进免疫再障小鼠的造血干、祖细胞增生，增加ＣＤ_（３４）抗原分子的表达。

Norplant使用者子宫内膜中层粘连蛋白、血管内皮生长因子及CD_(34)含量的研究

对未使用 Norplant和使用 Norplant0 .5年、1年及 2年以上的无不规则子宫出血与有不规则子宫出血的人子宫内膜进行研究 ,比较观察形态学变化以及内膜中层粘连蛋白、血管内皮生长因子及内皮细胞的 CD34 的含量 ,结果显示 1 .Norplant使用者子宫内膜增殖期特点消失 ;2 .血管内皮变薄 ;3.不规则出血的内膜中血管基膜层粘连蛋白、血管内皮生长因子明显减少。提示 Norplant使用者子宫不规则出血与内膜血管内皮变薄。

肝细胞癌血窦CD_(34)表达的意义

目的比较肝细胞癌、肝硬化和结节状增生中血管内皮细胞标记物CD34 、UEA -Ⅰ和Ⅷ因子的表达及意义。 方法对 36例手术切除肝细胞癌 ,其中 19例癌旁肝硬化、4例结节状增生及 2例正常肝组织进行免疫组织化学标记。 结果 1.CD34 在所有肝细胞癌 (HCC)血窦中均有较强阳性的表达 ,肝硬化 ,结节状增生及正常肝组织血窦中仅 3例有弱阳性的CD34 表达 ;2 .UEA -Ⅰ在HCC、肝硬化及结节状增生中均有较强阳性的血窦表达。CD34 在HCC血窦中表达与肝硬化、结节状增生相比显著增强 (P <0 .0 1) ;UEA -Ⅰ在HCC和肝硬化、结节状增生血窦表达无显著差异 (P >0 .0 5 )。 结论HCC与肝硬化、结节状增生血窦CD34 表达的差异可能与肿瘤的血管形成有关 ,而非简单的毛细血管化 ;CD34

C-kit受体和CD_(34)在急性髓系白血病中的表达与化疗疗效关系

目的：探讨c－kit受体、CD34的表达与化疗疗效的关系。方法：应用流式细胞仪，测定10例正常人和87例急性髓细胞白血病骨髓c-kit受体和CD34的表达。结果：正常人骨髓c-kit受体和CD34表达率分别为0．5％和1．7％。以＞20％细胞表达为阳性，患者c-kit受体和CD34阳性率分别为52％和37％、结论：c-kit受体和CD34阳性病例缓解率较低，差异有显著性（P＜0．01），c-kit受体及CD34共同表达者疗效尤差（P＜0．005）。

白血病bcl-2、CD_(34)表达的临床意义

目的探讨白血病bcl-2、CD34表达的临床意义和相关性。方法用ABC免疫细胞化学方法检测77例急性白血、23例慢性粒细胞白血病bcl-2、CD34的表达。结果复发／难治急性白血病bcl-2、CD34的表达高于初治者；慢粒白血病加速期／急变期组高于慢性期组。bcl－2、CD34高表达的急性白血病完全缓解率低，早期复发率高.bcl-2与CD34的表达呈轻度正相关（r＝0．367，P＜0．001）。结论bcl－2、CD34高表述可能与急性白血病预后不良有关。bcl－2的表达增高可能是CD34高表达的急性白血病预后不良的原因之一。

高白细胞性急性白血病CD_(34)抗原表达及临床意义

目的 :探讨高白细胞性白血病细胞CD3 4表达状况及意义。方法 :免疫细胞化学SP法。结果 :2 9例患者CD3 4+ 62 %,高表达 2 9 4 %,显著高于对照组 ,CD3 4+ 者化疗缓解率低 ,生存期短。结论 :高白细胞性白血病表达CD3 4较高 ,CD3 4+

基质金属蛋白酶-2、CD_(34)标记微血管密度在胆囊癌组织中的表达及临床意义

目的:研究基质金属蛋白酶-2(MMP-2)及CD_(34)标记微血管密度(CD_(34)-MVD)在胆囊癌中组织的表达水平及两者的相关性。方法:应用免疫组织化学的方法检测52例胆囊癌和25例慢性胆囊炎组织中MMP-2、CD_(34)-MVD的表达,并探讨两者的表达与胆囊癌临床特征的关系。结果:MMP-2在胆囊癌和慢性胆囊炎中表达比较差异有统计学意义(P<0.05),其中在慢性胆囊炎组织阳性表达率为24.0%(6/25),在胆囊癌组织中阳性表达率为78.8%(41/52);CD_(34)-MVD在胆囊癌为(53.6±8.9),慢性胆囊炎为(19.6±4.15),两者之间表达水平比较有统计学差异(P<0.05)。MMP-2、CD_(34)-MVD在胆囊癌中的表达呈正相关(r=1.3794,P=0.0062)。结论:在胆囊癌组织中MMP-2及CD_(34)-MVD高表达,在胆囊癌判断上具有一致性,两者可能促进胆囊癌的发生、发展、侵袭及转移。

CD_(34)抗体对特发性血小板减少性紫癜患者巨核系祖细胞作用的观察

应用CD_(34)抗体结合骨髓巨核系祖细胞(CFU—Meg)培养法观察了22例特发性血小板减少性紫癜(ITP)患者CFU—Meg的产率及CD_(34)抗原的表达。结果表明:ITP患者的巨核细胞产率与10例正常对照者差异不显著(P>0.05);CD_(34)抗体在体外对ITP及正常人CFU—Meg均有识别抑制作用,二者之间差异不显著。从而推测ITP的发病机理不在干细胞及祖细胞水平。

人脐血间充质干细胞对脐血CD_(34)^+细胞体外扩增作用的研究

目的探讨含人脐血来源的间充质干细胞(MSCs)体系在体外对脐血造血干细胞(HSCs)扩增作用。方法(1)用含人脐血MSCs及不同造血生长因子(HGFs)组合的无血清扩增体系对人脐血CD+34细胞进行体外扩增。(2)于扩增前及扩增后第6、12天分别用双色流式细胞仪动态检测HSCs表面抗原标记:CD+34、CD+34CD-38、CD+34CD+3、CD+34CD+19、CD+34CD+33和CD+34CD+41a细胞的含量。(3)按本实验室方法行体外半固体培养,观察扩增前后脐血细胞粒单核细胞集落形成单位(CFUGM)、爆式红系集落形成单位(BFUE)、混合集落形成单位(CFUMix)及高增殖集落形成单位(CFUHPP)集落形成情况。结果(1)含人脐血MSCs体系对脐血CD+34CD38细胞的扩增倍数在第6天和第12天分别为159和437倍。该亚群百分比在单纯因子组扩增第12天时为1.98%,而在含脐血MSCs组为9.98%,明显高于扩增前。(2)集落培养表明,含脐血MSCs组扩增第12天与扩增第6天相比,其CFUMix和CFUHPP的扩增倍数增加,而单纯因子组这两种集落的扩增倍数下降。(3)随扩增天数的增加,两组扩增体系中CD+34CD+3和CD+34CD+41a细胞均明显增加,而CD+34CD+19和CD+34CD+3细胞均明显减少。两组相比,含脐血MSCs组差异更显著。结论(1)含脐血MSCs体系不仅能扩增更原始的造血干/祖细胞(HSPC),且具有在短期内(12d)保持HSCs不耗竭。(2)含脐血MSCs体系对脐血CD+34细胞向定向祖细胞的扩增,主要为髓系及巨核系祖细胞,而对其向淋巴系祖细胞的扩增具有抑制作用。

米托蒽醌方案对CD_(34)^+高表达急性淋巴细胞白血病的临床疗效观察

目的探讨米托蒽醌(MTZ)在急性淋巴细胞白血病(ALL)化疗中的作用特点。方法50例CD3+4抗原高表达的ALL,随机选择二种化疗方案(COMP,CODP),联合化疗1个疗程后分别比较CR率、骨髓抑制及其他毒副作用;同时将骨髓白血病细胞体外培养72h,进行药物杀伤效应实验,分别比较MTZ、柔红霉素(DNR)在体外对ALL细胞不同分化阶段的抑制作用。结果CD34抗原高表达的ALL中,以MTZ为主的COMP方案的1个疗程缓解率为92.6%,比CODP方案高27.4%。体外白血病细胞培养加药物抑制试验结果显示,MTZ对分化较早阶段的CD3+4ALL细胞的抑制显著高于DNR。结论MTZ对ALL具有较强的抗白血病活性,临床骨髓抑制明显。上述特点可能与其主要作用于白血病细胞的分化较早阶段有关。

脐血CD_(34)^+CD_(19)~－细胞与体外培养集落的相关性分析

用两种单克隆抗体（单抗）标记脐血造血祖细胞表面抗原（ＨＰＣＡ，ＣＤ＿（３４））用流式细胞仪分析，并比较两种单抗标记的细胞与体外培养的粒单细胞集落形成单位（ＣＦＵ－ＧＭ），红系爆式集落形成单位（ＢＦＵ－Ｅ）和混合集落形成单位的相关性，结果表明脐血有核细胞中，抗ＨＰＣＡ－２－ＦＩＴＣ阳性的细胞占１．０５１０．７２％，Ｔｕｋ３（纯抗体）阳性细胞占２．０６±１．２５％，差别显著（Ｐ＜０．０５），每μｌ脐血两种单抗标记的细胞分别为９６．５６±５６．６４和２３１．４０±１６３．９３（Ｐ＜０．０５），变异系数依次为５８．４７％和６８．４３％。尽管抗ＨＰＣＡ－２－ＦＩＴＣ阳性细胞与阳性细胞数量呈显著正相关，但前者与ＣＦＵ－ＧＭ，ＢＦＵ－Ｅ，ＣＦＵ－Ｍｉｘ以及ＣＦＵｓ（ＣＦＵ－ＧＭ＋ＢＦＵ－Ｅ＋ＣＦＵ－Ｍｉｘ）均呈正相关，而后者仅与ＣＦＵ－ＧＭ，ＣＦＵｓ呈正相关。研究结果提示在检测造血祖细胞时，用抗ＨＰＣＡ－２－ＦＩＴＣ代替可降低假阳性，获得较好的细胞与ＣＦＵ间的线性关系。

急性髓系白血病细胞CD_（34）抗原表达的研究Ⅰ表达特点和临床意义

对５６例初发急性髓系白血病（ＡＭＬ）细胞ＣＤ＿（３４）抗原的表达作了检测，分析了ＣＤ＿（３４）抗原表达与临床表现及化疗疗效的关系。结果显示，ＡＭＬ细胞的ＣＤ＿（３４）表达率存在很大差别，从１％～８５％；５６例ＡＭＬ中ＣＤ＿（３４）阳性表达病例为２３例，占４１．１％。ＣＤ＿（３４）抗原表达与ＦＡＢ形态学分型无关，但Ｍ＿３型的表达阳性率明显低于Ｍ＿１、Ｍ＿２型。ＣＤ＿（３４）￣＋病例组与ＣＤ＿（３４）￣－病例组在年龄、性别及初发时白细胞总数、血红蛋白浓度、血小板计数等均无明显差异；在诱导化疗疗效上，ＣＤ＿（３４）￣＋组完全缓解率为４３．５％，明显低于ＣＤ＿（３４）￣－组的７２．７％。研究结果提示，ＡＭＬ细胞在ＣＤ＿（３４）抗原的表达上存在异质性；并具有一定的预后判断价值，建议对ＣＤ＿（３４）￣＋病例施行更为有效的、可能需与ＣＤ＿（３４＿￣－病例不同的化疗。