靶向性质粒表达载体pcDNA3.1(-)CMV·Egr-1CDglyTK的构建及转染研究

目的 构建靶向性基因治疗载体pcDNA3.1(-)CMV·Egr—1CDglyTK并进行转染研究。方法采用PCR、RT—PCR、融合PCR、酶切、连接等技术构建pcDNA3.1(-)CMV·Egr—1CDglyTK表达载体,成功转染鼻咽癌CNE—2细胞,绘制细胞相对存活率曲线,初步研究该载体在前体药物干预下对CNE—2细胞生长的影响。结果 表达pcDNAA3.1(-)CMV·Egr—1CDglyTK的CNE—2细胞在5—FC/GCV干预下生长受到抑制。结论pcDNA3.1(-)CMV·Egr—1CDglyTK可作为鼻咽癌基因治疗的载体。

放射诱导启动子的合成与鉴定及质粒pcDNA3.1(+)/E-CDglyTK的构建

【目的】合成放射诱导启动子序列并构建其调控双自杀基因的真核表达质粒pcDNA3.1(+)/E-CDglyTK。【方法】利用人工寡核苷酸片段合成放射诱导启动子,以绿色荧光蛋白(GFP)作为报告基因转染Tca8113细胞,经流式细胞仪鉴定其辐射诱导特性。将pCEA-CDglyTK中双自杀基因CDglyTK亚克隆到pcDNA3.1(+),然后把合成启动子插入到CDglyTK上游构建质粒pcDNA3.1(+)/E-CDglyTK并酶切鉴定,阳离子脂质体介导其转染舌鳞癌Tca8113细胞,RT-PCR观察CDglyTK表达及诱导放疗的增效作用。【结果】合成启动子序列分析与设计序列完全一致;低剂量放射线照射可诱导这种人工启动子增强GFP在Tca8113细胞中的表达;重组质粒的酶切图谱与预期一致;3Gy放疗显著增强CDglyTK在Tca8113细胞中的表达。【结论】成功合成放射诱导启动子并构建由其调控双自杀基因的真核表达质粒pcDNA3.1(+)/E-CDglyTK,为进一步研究肿瘤放射-基因治疗奠定了基础。

融合自杀基因CDglyTK治疗喉癌的体外实验研究(英文)

目的研究融合自杀基因CDglyTK治疗喉癌。方法PCR扩增、酶切、连接、转化等构建质粒表达载体pcDNA3.1(-)CMV.CDglyTK,XhoⅠ/HindⅢ酶切鉴定,测序分析CDglyTK基因序列。建立稳定表达CDglyTK基因的Hep-2细胞株,RT-PCR及Western-blotting鉴定CDglyTK基因的表达。MTT法观察5-FC、GCV、5-FC+GCV对表达CDglyTK基因的Hep-2细胞生长的抑制作用。结果酶切和基因测序分析证明重组质粒含完整的CD及TK基因,RT-PCR从转染细胞总RNA中扩出707bp的预期片段,West-ern-blotting检测到该基因表达的59kDa的蛋白。表达CDglyTK基因的Hep-2细胞在5-FC、GCV、5-FC+GCV干预下生长受到抑制,5-FC与GCV联合有更强的杀伤效应。结论CDglyTK融合自杀基因可以成为基因治疗喉癌的有效方法。

重组溶瘤腺病毒rAd-E1A-CDglyTK的构建和体内、外抑杀瘤作用的实验研究

目的构建重组溶瘤腺病毒r Ad-E 1A-CDgly TK,并研究其在体内、体外杀瘤作用的应用。方法选取2011年2月~2013年12月北华大学附属医院收治的卵巢癌患者100例,随机均分为治疗组与对照组（n=50）,治疗组采取患者的癌症细胞SKOV 3细胞,将病毒质粒经介质传染给癌症细胞并进行PCR体外扩增,经紫外线分光光度法检测病毒颗粒浓度,以TCID 50法检测感染性滴度,并计算病毒比活性,保证植入的病毒含有E 1A基因片段;对照组患者进行体内植入重组溶瘤腺病毒r Ad-E 1A-CDgly TK,观察抑制杀瘤疗效。结果经PCR体外扩增,得到DNA片段,进行凝胶电泳,可知植入的重组溶瘤腺病毒含有E 1A基因片段。通过紫外线分光光度法测得治疗组病毒颗粒浓度比上测得的感染性滴度得到病毒比活性为3.56%,显著高于对照组2.01%（P〈0.05）。进行体外抑瘤实验中,治疗组注入病毒成分为r Ad-E 1A-CDgly TK,其对SKOV 3细胞的生长抑制率为（16.59±1.57）,显著高于含有r AdCDgly TK的对照组生长抑制率（10.80±1.47）（P〈0.05）。体内抑瘤实验中,治疗组生长抑制率为（26.12±8.11）,显著高于对照组（1.69±4.12）,差异有统计学意义（P〈0.05）。结论重组溶瘤腺病毒r Ad-E 1A-CDgly TK具有较好的抑制杀瘤作用,其中体内杀瘤强于体外杀瘤,疗效显著,值得推广使用。

CDglyTK自杀基因系统治疗小鼠慢性粒细胞白血病皮下移植瘤的研究

为了探讨逆转录病毒介导的CDglyTK自杀基因系统对K562细胞的体内外杀伤作用,将逆转录病毒介导的CDglyTK自杀基因转染入K562细胞,体外实验用MTT法观察5-氟胞嘧啶/丙氧鸟苷(5-fluorocytosine/ganciclovir,5-FC/GCV)对K562/CDglyTK细胞的生长抑制率。体内实验时将K562/CDglyTK细胞和K562细胞接种于裸鼠皮下,使用GCV和5-FC后,观察裸鼠肿瘤体积的变化及裸鼠的生存率。体外实验表明,GCV联合5-FC对K562/CDglyTK细胞具有明显的杀伤作用;体内实验结果显示,皮下注射K562细胞和K562/CDglyTK细胞后小鼠成瘤率无明显区别;使用5-FC/GCV可明显抑制裸鼠体内的肿瘤形成;经5-FC/GCV治疗后K562/CDglyTK组的肿瘤体积较对照组明显缩小,裸鼠生存率也较对照组明显提高。结论:双自杀基因在体内外对K562细胞均有杀伤作用。

CDglyTK双自杀基因杀伤C6胶质瘤细胞的体内实验研究

目的观察CDglyTK双自杀基因对C6实体胶质瘤生长的抑制作用。方法利用逆转录病毒介导的大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶（CD）和单纯疱疹病毒胸苷激酶（HSV-TK）融合基因转染小鼠C6实体胶质瘤，RT—PCR检测分析融合基因的表达，并观察对照组和治疗组肿瘤体积、重量、抑瘤率及生存期的变化，同时观察其对C6胶质瘤细胞凋亡的影响，分析CDglyTK双自杀基因系统对肿瘤的抑制作用。结果RT—PCR检测显示逆转录病毒介导的CDglyTK双自杀基因在C6胶质瘤中有表达。对照组第4周肿瘤已长至20mm×30mm大小，并出现小鼠死亡现象，至第6周末全部死亡：治疗组肿瘤体积未增长，约51mm大小，部分肿瘤消失。肉眼观察可见对照组肿瘤体积大，色红．血供丰富，治疗组肿瘤体积减小或消失。21d后处死取瘤称重，对照组[（2．51±0．58）翻与治疗组肿瘤质量[（0．35±0．26）g]比较差异有统计学意义（P〈0．05），治疗组抑瘤率为86．1％。流式细胞仪检测可见治疗组细胞凋亡率（34．41％±5．20％）明显高于对照组（2．92％±1.30％），差异有统计学意义（氏0．05）。电镜观察可见治疗组肿瘤细胞凋亡小体形成。结论CDglyTK双自杀基因联合双前药治疗能取得显著的抗胶质瘤作用。

CDglyTK融合自杀基因杀伤喉癌Hep-2细胞的体外实验研究

目的:研究融合自杀基因CDglyTK联合前体药物对喉癌Hep-2细胞的杀伤效应。方法:构建质粒表达载体pcDNA3.1(-)CMV.CDglyTK,XhoⅠ/HindⅢ酶切鉴定,测序分析CDglyTK基因序列。电穿孔法将重组质粒转染Hep-2细胞,400mg/LG418筛选14d获得稳定表达CDglyTK基因的Hep-2细胞,RT-PCR及Western-blotting鉴定CDglyTK基因的表达。以转染空白载体pcDNA3.1(-)的Hep-2细胞为对照,MTT法观察5-FC、GCV、5-FC加GCV对表达CDglyTK基因的Hep-2细胞生长的抑制作用。结果:酶切和基因测序分析证明重组质粒含完整的CD及TK基因,RT-PCR从转染细胞总RNA中扩出707bp的预期片段,Western-blotting检测到该基因表达的分子量为59000的蛋白。表达CDglyTK基因的Hep-2细胞在5-FC、GCV、5-FC加GCV干预下生长受到抑制,5-FC与GCV联合有更强的杀伤效应。结论:CDglyTK融合自杀基因可以成为基因治疗喉癌的有效方法。

hTERT启动的双自杀基因CDTK载体的构建

目的:构建hTERT启动子启动的双自杀基因载体CDTK(pc-ChCDTK)。方法:利用PCR扩增CMV增强子、hTERT启动子、yCD及TKgly4种元件,并构建过渡载体T-CMV,T-hTERT,T-yCD,T-TKgly,连至pc-DNA3.1(-)质粒载体上构建成双自杀基因载体pc-DNA3.1-CMV-hTERT-CDTK(pc-ChCDTK);对各个元件、过渡载体及最终载体进行琼脂糖凝胶电泳、酶切和测序鉴定。结果:实验所构建的最终载体的酶切产物琼脂糖凝胶电泳所得片段大小分别为6773bp和288bp,与预期片段一致;测序证实最终载体与pc-ChCDTK序列一致。结论:成功构建了含有hTERT启动子的肿瘤特异性双自杀基因载体pc-ChCDTK。

聚乙二醇-聚谷氨酸纳米微球介导双自杀基因治疗金黄地鼠颊癌的实验研究

目的:观察聚乙二醇-聚谷氨酸(PEG-PBLG)纳米微球介导双融合自杀基因CDglyTK治疗金黄地鼠颊癌的疗效。方法:用二甲基苯并蒽(DMBA)诱导金黄地鼠颊黏膜癌变,建立颊癌动物模型。以PEG-PBLG纳米微球为载体,介导携双自杀基因CDglyTK的真核表达质粒pcDNA3．1(+)-CDglyTK瘤内转染,腹腔注射5-氟胞嘧啶(5-FC)和丙氧鸟苷(GCV),描绘肿瘤生长曲线,RT-PCR检测CDglyTK的mRNA水平,免疫组化检测细胞核增殖抗原的表达,原位末端标记法检测肿瘤细胞凋亡。采用SPSS10．0统计软件包进行两样本均数X^2检验。结果:成功建立金黄地鼠颊癌模型,RT-PCR可检测到转染肿瘤细胞中CDglyTK的mRNA表达;腹腔注射5-FC和GCV后,肿瘤生长受到明显抑制;联合使用5-FC和GCV的金黄地鼠颊癌生长抑制作用明显优于单用5-FC或GCV。5-FC和GCV联合使用组,凋亡指数(AI)显著高于对照组(P＜0．01),同时增殖指数(PI)则显著低于对照组(P＜0．01)。结论:PEG-PBLG纳米载体介导双自杀基因CDglyTK可有效治疗金黄地鼠颊癌,为口腔鳞癌的基因治疗提供了新的思路。

聚乙二醇-聚谷氨酸纳米微球介导双自杀基因对Tca8113细胞的杀伤作用

目的:观察聚乙二醇-聚谷氨酸(PEG-PBLG)纳米微球介导双融合自杀基因CDglyTK对舌鳞癌Tca8113细胞的杀伤作用,为口腔鳞癌的治疗探索新的途径和方法。方法:以PEG-PBLG纳米微球为载体介导携双自杀基因CDglyTK的真核表达质粒pcDNA3.1(+)-CDglyTK转染Tca8113细胞,通过RT-PCR检测CDglyTK的mRNA表达,MTT法描绘细胞生长曲线,流式细胞仪检测细胞凋亡并评价其疗效。统计分析采用SPSS10.0统计软件包完成,两样本均数的比较采用t检验。结果:PEG-PBLG纳米微球可介导质粒pcDNA3.1(+)-CDglyTK转染Tca8113细胞,RT-PCR可检测到转染细胞中CDglyTK的mRNA表达。转染后,细胞在滴加5-FC和GCV后生长受到明显抑制,5-FC和GCV联合使用对Tca8113细胞的生长抑制作用明显优于单用5-FC或GCV。5-FC和GCV联合使用组,凋亡指数显著高于对照组(P<0.01),同时也高于单独使用5-FC或GCV组(P<0.05)。结论:PEG-PBLG纳米载体介导双自杀基因CDglyTK,可有效杀伤舌鳞癌Tca8113细胞,为舌鳞癌的基因治疗提供了新的途径。

双自杀基因CDTK载体系统对人视网膜母细胞瘤Y79细胞体外杀伤作用的研究

目的:研究肿瘤特异性双自杀基因载体pc-ChCDTK对人视网膜母细胞瘤Y79细胞的体外杀伤作用。方法:将双自杀基因载体pc-ChCDTK电转染Y79细胞株。通过RT-PCR和Western blot方法确定CDTK在体外培养的细胞中表达情况。用HPLC法测定转染Y79细胞中5-FC向5-FU的转化效率。向载体转染和未转染的Y79细胞中加入不同浓度的前体药物5-FC(0,25,50,100,200,400,800mg/L)和/或GCV(0,2,4,8,16,32,64mg/L),5d后用MTT法检测Y79细胞的平均存活率。结果:双自杀基因载体pc-ChCDTK电转染Y79细胞成功:在载体转染的Y79细胞中,RT-PCR扩增出长度为403bp的特异条带,Western blot检测见一59kD大小的条带,与CDTK基因序列分析的预期结果一致。双自杀基因载体系统致Y79细胞存活率降低:转染Y79细胞中,5-FC向5-FU转化的效率为84.5%。转染和未转染Y79细胞中加入5-FC或GCV后平均细胞存活率均随浓度增加而降低,两组比较当5-FC浓度达到100mg/L,GCV浓度达到8mg/L后各对应浓度组间均存在差异(P<0.05)。转染组间比较,当5-FC达200mg/L,GCV达16mg/L后,5-FC+GCV组平均细胞存活率低于单加5-FC或GCV组,有统计学差异(P<0.05)。结论:双自杀基因载体pc-ChCDTK转染Y79细胞后,在Y79细胞被转录和翻译成CDTK双自杀基因蛋白。给予5-FC和GCV达到一定浓度时,它们转化成细胞毒性物质对Y79细胞产生杀伤作用。双前体药物的杀伤作用大于单前体药物。

双自杀基因CDTK载体系统对裸小鼠Y79细胞皮下移植瘤的杀伤作用

目的:研究肿瘤特异性双自杀基因载体系统pc-ChCDTK对视网膜母细胞瘤的体内杀伤作用。方法:用G418筛选载体阳性转染的Y79细胞;通过皮下注射载体转染和未转染的Y79细胞致瘤BALB/C小鼠,每组10只。Y79细胞皮下移植术7d后,向成瘤裸小鼠腹腔注射前体药物5-Fc+GCV(5-Fc 500mg/kg+GCV 30mg/kg),连续给药15d,每天测量1次皮下移植瘤长径和短径,计算体积。末次给药后3d处死裸小鼠,取皮下移植瘤组织做HE染色,并提取组织RNA,用RT-PCR检测CDTK的表达。结果:未转染组裸小鼠8只成瘤,转染组裸小鼠7只成瘤。两组比较,转染组皮下移植瘤的体积较未转染组小,有统计学差异(P<0.05);转染组瘤组织HE染色中可见散在坏死组织。转染组皮下移植瘤组织中检测到403bp片段,与CDTK预期mRNA大小一致。结论:双自杀基因载体pc-ChCDTK系统对裸小鼠的视网膜母细胞瘤皮下移植瘤的生长有抑制作用。