荧光共振能量转移技术阳性参照质粒的构建及应用

目的构建青色荧光蛋白(CFP)基因和黄色荧光蛋白(YFP)基因相连接的真核表达载体pYFP-CFP,并检测融合蛋白CFP-YFP的FRET转移效率,为FRET技术提供阳性参照物。方法利用基因重组法,以带有CFP基因序列的质粒(p CFP)为模板,扩增CFP基因并插入黄色荧光蛋白载体(pYFP)的多克隆位点中,构建真核表达质粒pYFP-CFP。经细胞转染后,使其表达CFP和YFP相连的融合蛋白。在激光共聚焦显微镜下采集FRET信号图和FRET转移效率(EFRET)的计算,并比较和分析表达CFP-YFP的阳性细胞与CFP和YFP共表达的阴性细胞。结果真核表达质粒pYFP-CFP构建成功,并在细胞质中表达,这与p CFP和pYFP共转染的细胞中荧光蛋白的分布略有不同,后者在细胞胞质和细胞核中均有表达。统计结果显示表达融合蛋白的阳性组EFRET明显高于共表达的阴性组,差异有统计学意义。结论融合荧光蛋白分子的青色和黄色蛋白之间具有10个氨基酸残基相连,符合FRET现象发生的条件,能够采集到很强的FRET信号,可作为FRET研究的稳定阳性实验参照。

三通道荧光共振能量转移分析法的优化及其对活细胞内受体复合物组成的分析

目的在活细胞内建立并优化三通道FRET检测方法,使之更好地适用于膜蛋白复合物亚单位的相互作用。方法利用在HEK293细胞中转染pCFP-YFP作为阳性对照,共转pCFP和pYFP作为阴性对照,用不同的公式如FRETN、NFRET、FR及NetFRET/Df等进行FRET定量计算,并通过改变供体与受体比例来观察所测得的FRET值与FRET转移效率的关系。在HEK293细胞内转染CFP或YFP标记的不同亲离子型谷氨酸受体(iGluR)亚单位,分析它们之间的相互作用。结果FRETN、NFRET、FR及NetFRET/Df等公式均可以适用于本研究所建的三通道FRET检测系统;对于不同的公式,供体与受体蛋白分子表达比例的变化会对测量结果产生不同的影响。用所建FRET技术,发现CFP-GluRl与YFP-GluRl之间,以及CFP-NRl与YFP-NRl具有确定FRET信号,而CFP-GluRl与YFP-NRl则没有FRET发生。结论在对不同iGluR亚单位之间相互作用的研究中证明同一受体亚型中的亚单位之间可以形成同聚体,而不同受体亚型的亚单位之间则不会形成复合物。