结核杆菌实时荧光定量PCR快速检测方法的建立及应用

针对结核杆菌CFP10基因序列设计并合成了1对引物,以构建的含有该引物扩增序列的重组质粒作为阳性标准品,建立了检测CFP10基因的SYBR GreenⅠreal-timePCR方法。检测结果显示,该方法线性关系好,标准曲线的相关系数达到0.997,对初始模板的检出下限为1×101copies/μL,比常规PCR方法高100倍。表明建立的real-time PCR检测方法灵敏度高、特异性强、重复性好,可以用于结核杆菌CFP10的病原检测及定量分析。

结核分枝杆菌lhp基因原核表达载体的构建和表达

目的 :构建结核分枝杆菌 (MTB)lhp基因原核表达载体并进行表达。方法 :用PCR扩增MTBlhp基因 ,并克隆入pQE30质粒。测序正确后 ,再亚克隆入 pET32a(+)质粒 ,构建pQE30 CFP10和pET32a(+) CFP10重组体。 结果 :以重组体分别转化DH5α和BL2 1(DE3)菌后 ,经IPTG诱导 ,pQE30 CFP10未表达目的蛋白 ;而 pET32a(+) CFP10则表达出Mr 为 2 0 0 0 0左右重组蛋白。SDS PAGE分析显示 ,IPTG诱导 4h重组蛋白的表达量最高。表达蛋白以可溶性非包涵体形式存在于胞质中 ,表达量占全菌蛋白质的 38% ,用Westernblot证实其具有良好的抗原性。经Ni NTA柱纯化 ,获得纯度为 93%的重组蛋白。结论 :成功地构建原核表达载体 pET32a(+) CFP10 ,并获得重组CFP10蛋白 ,为MTB重组抗原的应用奠定了基础。

结核分枝杆菌CFP10和ESAT6优势肽段融合蛋白的表达及其免疫学研究

目的:构建结核分枝杆菌分泌蛋白的重组质粒及工程菌,获得纯化的CFP10-ESAT6P蛋白抗原,制备初步用于检测结核病患者的特异性抗体。方法:根据编码结核分枝杆菌基因序列设计引物,克隆表达结核CFP10-ESAT6重组蛋白,表达产物免疫新西兰大白兔,其中80%可产生高价的抗体。利用产物建立IgG间接ELISA方法鉴定其抗原性及实用性。结果:应用ELISA法,通过检测113例结核病患者、82例非结核病患者及健康献血员,CFP10-ESAT6P和对照PPD对结核病患者血清检测的敏感性分别为89.4%和79.6%,特异性分别为96.3%和93.9%。结论:高效表达纯化的CFP10-ESAT6蛋白抗原性强,可用于结核病患者抗体的检测,用于结核病的辅助诊断。