嗜热脂肪土芽孢杆菌CHB1生长特性与培养条件研究

目的：研究嗜热脂肪土芽孢杆菌CHB1的生长特性与培养条件。方法：以菌体生长量为主要评价指标,利用单因子试验与正交试验相结合的方法对影响CHB1生长的主要因素进行分析。结果：CHB1最低和最高生长温度分别为45℃和74℃,最佳培养温度为60℃;最低和最高起始生长pH值分别为6.5和9.0,最适起始pH为8.0;菌体生长到达对数期的时间为15-18h;接种量2%,装液量40mL,转速180r/min。结论：CHB1为高温菌,生长pH范围偏碱性,条件优化后总菌体浓度可达1.1×10^9CFU/mL。

嗜热脂肪土芽孢杆菌CHB1发酵培养基的优化

以菌体生长量和pH值作为培养基优化的指标,对嗜热脂肪土芽孢杆菌CHB1发酵培养基成分进行了筛选与优化。结果表明,不同碳氮源对发酵液菌数影响相差较大,最佳培养基配比为:牛肉膏、大豆蛋白胨、NaCl、K2HPO4和KH2PO4;最佳摇瓶发酵配方为:牛肉膏0.5%,大豆蛋白胨0.9%,NaCl 0.2%,K2HPO4∶KH2PO4为0.1%∶0.075%,该培养基中培养CHB1比在发酵基础培养基中培养菌量提高10倍以上。

嗜热脂肪土芽孢杆菌CHB1固体发酵工艺

以菌量为指标,以麸皮、豆粕为基本发酵原料,通过单因素试验与正交试验,对嗜热脂肪土芽孢杆菌CHB1固体发酵培养基与培养条件进行优化。结果表明,CHB1最佳固体发酵工艺为:250mL三角瓶中装麸皮11.3g,豆粕3.7g,pH8.0磷酸缓冲液润湿混匀,含水量50%,接种量15%(V/m),55℃,培养24h,菌量达8.12×108CFU·g-1,比优化前提高8倍以上。通过对CHB1固体发酵工艺的优化,可实现CHB1高密度培养,降低CHB1生产成本,提高其在堆肥化中的作用效果。

一株耐高温细菌CHB1的分离和产酶特性研究

从土壤中分离到1株耐高温细菌CHB1，经鉴定为嗜热脂肪土芽胞杆菌（Geobacillus tearothermophilus）。通过平板透明圈法研究其产酶特性，结果表明CHBl具有蛋白酶、淀粉酶和纤维素酶活性，产酶最适温度均为60℃；最佳产酶时间因酶的种类而不同，淀粉酶为24h，蛋白酶和纤维素酶为48h。培养基厚度对产酶有一定的影响，以每皿20-25mL为宜。

嗜热芽孢杆菌CHB1环糊精酶基因优化及其在毕赤酵母中的表达

为实现新型CGTase在毕赤酵母中的高效表达,提取嗜热芽孢杆菌CHB1基因组DNA为模块,PCR扩增野生型基因CGT1,编码680个氨基酸。将该基因进行密码子优化CGT2,与野生型基因CGT1分别插入分泌型载体pPICZαA转化毕赤酵母GS115,获得两株酵母工程菌GS115/pPICZαA-CGT1和GS115/pPICZαA-CGT2;经甲醇诱导表达120 h后,CGT2活力达0.62U/mL,是优化前CGT1(0.37 U/mL)活性的1.7倍;进一步对GS115/pPICZαA-CGT2进行摇瓶发酵条件优化,确定其最优发酵条件为:pH 6.5、28℃、200 r/min、每24小时补加体积分数1.5%的甲醇诱导,120 h后其胞外酶活力达到1.26 U/mL,是优化前的两倍。

嗜热脂肪土芽孢杆菌CHB1产蛋白酶特性

目的：研究嗜热脂肪土芽孢杆菌CHBl产酶特性。方法：以蛋白酶活力为主要指标，考察温度、pH、接种量、装量等条件对CHB1产蛋白酶的影响。结果：CHB1适宜的产蛋白酶条件为：装量40mLt250mL，pH8．0，接种量5％，温度58℃，转速180r／min，时间36～44h，Tween-80对CHB1产蛋白酶具有抑制作用。结论：优化后蛋白酶产量有较大提高，最高酶活力达48U／mL，是所报道多数嗜热细菌产蛋白酶量的2—12倍。CHB1蛋白酶特性的研究及产蛋白酶量的提高，有利于揭示CHB1在堆肥化中的作用机理，提高堆肥效果。

乳糖诱导对重组大肠杆菌表达CGTase的影响

以重组环糊精葡萄糖基转移酶(CGTase)表达菌株BL21(DE3)作为研究对象,比较IPTG和乳糖诱导对重组大肠杆菌表达CGTase量的影响,确定优化诱导方式。以Geobacillus CHB1的基因组DNA为模板,采用PCR技术克隆CGTase基因;利用分子操作技术构建携带有大肠杆菌Omp A信号肽的分泌型表达质粒p EASY-E2-Omp A-CGT,重组质粒热激转化至Escherichia coli BL21中进行表达;在摇瓶发酵条件下,分别以IPTG和乳糖作为诱导剂,通过SDSPAGE分析和测定胞外酶活,确定优化诱导方式。CGTase基因在Escherichia coli BL21中实现表达,且具有一定量的重组CGTase分泌至胞外;乳糖诱导的蛋白表达量优于IPTG诱导,不易形成包涵体;乳糖最佳的诱导起始菌浓度OD600为1.4,诱导浓度、温度分别为0.5%和25℃,分批流加乳糖5次和一次性加入,重组CGTase表达量无明显差异;经初步优化,胞外酶活达19.87 U/m L。Geobacillus CHB1 CGTase基因在大肠杆菌中成功实现胞外表达,乳糖可替代IPTG诱导重组CGTase。