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GPI-CTLA4Ig嵌合分子的构建和在CHO-dhfr^-细胞膜上的表达 被引量:3
1
作者 于继云 沈倍奋 +4 位作者 黎燕 陈兴 程绍辉 田蓉 曲梅花 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2003年第3期212-214,共3页
目的 :研制GPI锚定修饰的新型免疫抑制分子GPI CT LA4Ig。方法 :通过将从促衰变因子 (DAF)来源的GPI修饰性信号序列与CTLA4Ig嵌合 ,获得GPI修饰的CTLA4Ig分子。将编码GPI CTLA4Ig嵌合分子的基因克隆到真核表达载体pCI dhfr中 ,并用脂质... 目的 :研制GPI锚定修饰的新型免疫抑制分子GPI CT LA4Ig。方法 :通过将从促衰变因子 (DAF)来源的GPI修饰性信号序列与CTLA4Ig嵌合 ,获得GPI修饰的CTLA4Ig分子。将编码GPI CTLA4Ig嵌合分子的基因克隆到真核表达载体pCI dhfr中 ,并用脂质体法转染CHO dhfr 细胞 ,用氨甲喋呤 (MTX)进行筛选。重组蛋白的表达用RT PCR、ELISA、细胞免疫荧光和Westernblot进行鉴定。最后采用ProteinA亲和层析纯化。结果 :构建了GPI CTLA4Ig嵌合分子 ,并在CHO dhfr 细胞膜上稳定表达。结论 :GPI修饰的CTLA4Ig分子有可能作为新型的免疫抑制剂用于器官移植中 。 展开更多
关键词 CTLA4IG 蛋白质表达 糖基化磷脂酰肌醇 cho-dhfr^-细胞
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牛朊蛋白在CHO/dhfr-细胞中的稳定表达 被引量:4
2
作者 丁耀忠 张杰 +6 位作者 刘永生 陈豪泰 曾巧英 马丽娜 马艳平 杨生海 殷宏 《江西农业学报》 CAS 2009年第4期101-103,共3页
从T载体上得到的目的基因和dhfr共扩增基因真核表达载体构建了pCI-PrP102。纯化后的重组质粒通过脂质体转染CHO/dhfr-细胞,经MTX加压筛选获得稳定表达的细胞株,间接免疫荧光试验检测到目的蛋白的表达。
关键词 牛朊蛋白 二氢叶酸还原酶缺陷型cho细胞 稳定表达
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糖基化磷脂酰肌醇锚定型人B7-1融合蛋白在CHO/DHFR-细胞的稳定表达 被引量:2
3
作者 张淑敏 畅继武 +3 位作者 随志方 李振莉 马富玲 王馨 《免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2005年第6期532-534,539,共4页
目的建立稳定表达糖基化磷脂酰肌醇锚定型人B71(GPIB71)的CHO/DHFR-细胞表达体系。方法用Lipofectin介导法将真核细胞高效表达载体pCDNA3GPIB71和pSV40DHFR共转染CHO/DHFR-细胞,经免疫荧光流式细胞术检测,并提取膜蛋白进行Westenblot检... 目的建立稳定表达糖基化磷脂酰肌醇锚定型人B71(GPIB71)的CHO/DHFR-细胞表达体系。方法用Lipofectin介导法将真核细胞高效表达载体pCDNA3GPIB71和pSV40DHFR共转染CHO/DHFR-细胞,经免疫荧光流式细胞术检测,并提取膜蛋白进行Westenblot检测。结果经G418筛选和MTX加压扩增,获得高效表达目的蛋白的细胞株。膜蛋白经WesternBlot检测具有生物活性。结论GPIB71在CHO/DHFR-细胞中高效表达,为临床应用与研究奠定了基础。 展开更多
关键词 GPI-B7-1 cho/dhfr^-细胞 真核表达
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太空环境改变生物工程细胞CHO(dhfr^-)的生长特性 被引量:1
4
作者 徐梅 向青 +4 位作者 房青 李红艳 徐波 高福云 唐劲天 《中国生物工程杂志》 CAS CSCD 2004年第11期22-25,共4页
目的 :了解太空诱变对生物工程细胞CHO(dhfr-)生长特性的影响。方法 :将CHO(dhfr-)生物工程细胞株搭载于我国第 1 8颗返回式卫星 ,经 1 8天太空飞行 ,回收后对存活细胞进行单克隆化 ,获得 1 5 9株单克隆细胞。选取生长快、慢不同的 3株... 目的 :了解太空诱变对生物工程细胞CHO(dhfr-)生长特性的影响。方法 :将CHO(dhfr-)生物工程细胞株搭载于我国第 1 8颗返回式卫星 ,经 1 8天太空飞行 ,回收后对存活细胞进行单克隆化 ,获得 1 5 9株单克隆细胞。选取生长快、慢不同的 3株克隆 ,利用光镜、MTT法、FCM分析及3 H掺入法观察细胞生长特性。结果 :经太空诱变后 ,CHO(dhfr-)细胞呈多种形态 ;G1期细胞显著增多 ;生长速度和大分子生物合成呈现多向性变化 ,无特定规律性。结论 :太空环境可影响生物工程细胞CHO(dhfr-)的生长特性 ,为进一步筛选优化的生物工程细胞提供了可能。 展开更多
关键词 cho 细胞 单克隆 改变 MTT法 光镜 生物工程 生长特性 太空诱变 生长速度
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截短型人骨保护素在CHO-DHFR^-细胞中的表达及活性测定 被引量:1
5
作者 阚伯红 藏晓怡 +1 位作者 李兰英 赵孔银 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2009年第11期1002-1004,共3页
目的:构建截短型人骨保护素(hTOPG)哺乳动物表达载体pcDNA3.1/DHFR-hTOPG,实现其在CHO-DHFR-细胞中的高效表达,获取生物活性较高的重组蛋白。方法:利用基因重组技术构建重组表达载体pcDNA3.1/DHFR-TOPG,按LipofectamineTM2000试剂盒说... 目的:构建截短型人骨保护素(hTOPG)哺乳动物表达载体pcDNA3.1/DHFR-hTOPG,实现其在CHO-DHFR-细胞中的高效表达,获取生物活性较高的重组蛋白。方法:利用基因重组技术构建重组表达载体pcDNA3.1/DHFR-TOPG,按LipofectamineTM2000试剂盒说明书转染CHO-DHFR-细胞,以含50 mL/L透析血清的IMDM培养基培养,氨甲喋呤(MTX)加压筛选高表达细胞株,ELISA法和RT-PCR法测定重组蛋白和基因的表达,并采用破骨细胞样细胞(OLC)诱导分化抑制实验测定重组蛋白的体外活性。结果:重组蛋白的表达量最高可达6 mg/L.72 h,且能够明显抑制OLC生成(P<0.05)。结论:截短型人OPG在CHO-DHFR-细胞中成功高效表达,并具有良好的生物学活性,为进一步的实验研究和临床应用提供了基础。 展开更多
关键词 骨保护素 chodhfr-细胞 表达 活性分析
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定点整合人Bcl-2基因的CHO/dhfr-细胞株的建立 被引量:1
6
作者 许凌峰 刘志刚 +4 位作者 孙志伟 林建波 杜韫 刘姗 俞炜源 《生物技术通讯》 CAS 2005年第6期605-608,共4页
构建重组载体质粒pMCEfrt-Bcl-2,利用FIp-InTM定点重组系统,在CHO-dhfr-细胞内定点整合人Bcl-2基因,通过Western印迹检测重组细胞Bcl-2蛋白的表达。通过流式细胞仪和DNALadder检测在高NH4Cl条件下细胞的凋亡情况;用台盼蓝染色检测在无血... 构建重组载体质粒pMCEfrt-Bcl-2,利用FIp-InTM定点重组系统,在CHO-dhfr-细胞内定点整合人Bcl-2基因,通过Western印迹检测重组细胞Bcl-2蛋白的表达。通过流式细胞仪和DNALadder检测在高NH4Cl条件下细胞的凋亡情况;用台盼蓝染色检测在无血清IMDM培养基中细胞的活细胞数目和活细胞比例。结果获得了稳定表达Bcl-2基因的细胞株CHO-Bcl-2,该细胞株能高水平表达Bcl-2蛋白。在无血清培养过程中,CHO-Bcl-2细胞比对照细胞保持高约15%的活细胞比例,细胞总数高25%。CHO-Bcl-2在高NH4+(50mmol/L)培养条件下具有较低的凋亡水平。建立了能够高表达Bcl-2基因并具有一定的抗凋亡能力的重组CHO/dhfr-细胞株。 展开更多
关键词 cho/dhfr^-细胞 BCL-2基因 细胞培养 凋亡
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空间诱变致生长减慢CHO(dhfr^-)细胞株的特性
7
作者 李红艳 徐梅 +5 位作者 向青 房青 徐波 高福云 刘国铃 唐劲天 《中国康复理论与实践》 CSCD 2004年第11期647-648,共2页
目的了解空间环境下生物工程细胞CHO(dhfr-)在形态、生长和周期等方面的变化。方法将CHO(dhfr-)生物工程细胞株搭载于我国第 18颗返回式卫星 ,返地的细胞在倍增之前进行单克隆化。从中随机选取 4株细胞 ,经 5代培养确定一株生长速度最... 目的了解空间环境下生物工程细胞CHO(dhfr-)在形态、生长和周期等方面的变化。方法将CHO(dhfr-)生物工程细胞株搭载于我国第 18颗返回式卫星 ,返地的细胞在倍增之前进行单克隆化。从中随机选取 4株细胞 ,经 5代培养确定一株生长速度最慢的细胞株 ,利用光镜、MTT法、FCM分析法观察细胞生长特性。结果返地后的CHO (dhfr-)细胞经过单克隆化、扩增 ,获得 15 9个细胞株。经空间诱变后的细胞出现细胞形态改变、生长增殖速度减慢、G1期细胞明显增多。结论生物工程CHO(dhfr-)细胞经空间诱变可引起生长特性的改变 ,为筛选优化的生物工程制药细胞提供可能。 展开更多
关键词 cho(dhfr^-)细胞 空间 生长特性
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利用CHO(dhfr^-)细胞高效表达GM-CSFFc_(γ2)^-融合蛋白 被引量:1
8
作者 宁金鹰 王尊荣 许佐良 《济宁医学院学报》 2001年第1期27-29,共3页
目的 利用二氢叶酸还原酶缺陷型细胞CHO(dhfr - )高效表达融合蛋白GM -CSF Fcγ2-。方法 利用脂质体基因转染技术 ,把含有融合基因GM -CSF Fcγ2-的真核表达质粒pRc CMV2 GM -CSF Fcγ2-和含有二氢叶酸还原酶基因的真核表达质粒pSV2 ... 目的 利用二氢叶酸还原酶缺陷型细胞CHO(dhfr - )高效表达融合蛋白GM -CSF Fcγ2-。方法 利用脂质体基因转染技术 ,把含有融合基因GM -CSF Fcγ2-的真核表达质粒pRc CMV2 GM -CSF Fcγ2-和含有二氢叶酸还原酶基因的真核表达质粒pSV2 -dhfr共转染二氢叶酸还原酶缺陷型细胞CHO(dhfr - )中。用G4 18和撤除H、T(次黄嘌呤、胸腺嘧啶核苷 )双筛选 ,获得dhfr +neo +双表型阳性的细胞克隆。取表达产量最高的克隆进行亚克隆 ,并行MTX加压筛选 ,以提高表达量。用RT -PCR、ELISA和Westernblot对表达产物进行鉴定并行MTT法检测表达蛋白的生物学活性。结果 成功地表达出了具有GM -CSF生物学活性的融合蛋白GM -CSF Fcγ2-。结论 该方法可行 ,表达量达到 15μg ml。 展开更多
关键词 融合蛋白 基因表达 细胞cho GM-CSF/Feγ2^-
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人肠三叶因子重组真核表达载体的构建及在CHO/dhfr-细胞中的稳定表达
9
作者 朱融和 陈慧瑶 +1 位作者 庄强 江松福 《温州医科大学学报》 CAS 2016年第8期561-565,共5页
目的:构建人肠三叶因子(hITF)重组真核表达载体,并检测其在CHO/dhfr-细胞中的表达。方法:通过重叠延伸PCR法获得hITF cDNA片段,将目的基因插入真核表达载体pIRES/dhfr,得到重组真核表达载体pIRES/h ITF/dhfr;经脂质体介导转染CHO/dhfr-... 目的:构建人肠三叶因子(hITF)重组真核表达载体,并检测其在CHO/dhfr-细胞中的表达。方法:通过重叠延伸PCR法获得hITF cDNA片段,将目的基因插入真核表达载体pIRES/dhfr,得到重组真核表达载体pIRES/h ITF/dhfr;经脂质体介导转染CHO/dhfr-细胞,通过G418筛选,建立稳定转染的CHO/dhfr-细胞系;用RT-PCR及ELISA法检测hITF的表达。结果:成功构建了重组真核表达载体pIRES/hITF/dhfr,并建立了稳定转染的CHO细胞系,成功地表达了目的基因。结论:成功构建了重组真核表达载体pIRES/hITF/dhfr,并在CHO/dhfr-细胞中分泌表达hITF蛋白,为进一步进行重组hITF的临床前研究奠定良好的实验基础。 展开更多
关键词 人肠三叶因子 真核表达载体 cho/dhfr-细胞
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proUK-KGDW融合基因在CHO细胞中的高表达 被引量:2
10
作者 杜韫 刘志刚 +2 位作者 林建波 徐桂清 俞炜源 《生物技术通讯》 CAS 2005年第4期384-386,共3页
利用常规分子生物学技术,构建了新型高效的proUK-KGDW融合基因的分泌型哺乳动物细胞表达载体。将该载体线性化后转染CHO/dhfr-细胞,经G418筛选获得阳性克隆,然后挑取表达水平较高的克隆进行MTX加压扩增,以提高proUK-KGDW杂合体的表达水... 利用常规分子生物学技术,构建了新型高效的proUK-KGDW融合基因的分泌型哺乳动物细胞表达载体。将该载体线性化后转染CHO/dhfr-细胞,经G418筛选获得阳性克隆,然后挑取表达水平较高的克隆进行MTX加压扩增,以提高proUK-KGDW杂合体的表达水平,经2~3轮MTX加压扩增,获得多株表达水平超过10μg/(106细胞·24h)的稳定的高表达细胞株,为proUK-KGDW杂合体的制备及功能研究奠定了基础。 展开更多
关键词 proUK—KGDW融合基因 cho/dhfr^-细胞 重组蛋白 高表达
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用弱化dhfr双顺反子载体在CHO细胞中高效表达低分子量尿激酶突变体 被引量:1
11
作者 潘淑媛 高丽华 +6 位作者 胡显文 杨波 殷亮 胥照平 张正光 郗永义 陈惠鹏 《高技术通讯》 CAS CSCD 北大核心 2006年第8期834-840,共7页
将二氢叶酸还原酶基因(dhfr)克隆至pIRES载体中弱化的脑心肌炎病毒(ECMV)内部核糖体进入位点(IRES)的下游,构建了含有弱化dhfr筛选标记和可用氨甲蝶呤(MTX)加压提高表达水平的双顺反子真核表达载体pIRES—dhfr。利用该表达载... 将二氢叶酸还原酶基因(dhfr)克隆至pIRES载体中弱化的脑心肌炎病毒(ECMV)内部核糖体进入位点(IRES)的下游,构建了含有弱化dhfr筛选标记和可用氨甲蝶呤(MTX)加压提高表达水平的双顺反子真核表达载体pIRES—dhfr。利用该表达载体表达了一种无糖基化和具有凝血酶抗性的低分子量尿激酶型纤溶酶原激活剂(LMW—uPA)突变体(缺失尿激酶原的1—143位氨基酸,Arg156→Lys,Asn302→Ala),用脂质体转染方法将表达载体pIRES—dhfr/LMW—UK转染CHO—dhfr-细胞后经过一轮MTX筛选,几乎所有获得的单克隆细胞株都表达LMW—UK,其中约50%为表达水平较接近(500—5000IU/10^6cells/d)的高表达阳性克隆。用转瓶无血清培养表达水平约为17.5pg/cell/d的rCHO细胞系LB2-UK,收集的上清经过阳离子交换柱和凝胶过滤层析两步纯化后,获得的重组蛋白的纯度可以达到99%。用S-2444发色底物法检测,所获得的突变体双链UK比例大于98%。 展开更多
关键词 低分子量尿激酶 突变体 内部核糖体进入位点 二氢叶酸还原酶基因 重组cho细胞
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HIGH DENSITY CULTIVATION OF GENETICALLY-ENGINEERED CHO CELL LINES WITH MICROCARRIER CULTURE SYSTEMS 被引量:1
12
作者 肖成祖 黄子才 +2 位作者 刘凤云 郭志霞 高丽华 《Chinese Medical Sciences Journal》 CAS CSCD 1994年第2期71-74,共4页
Genetically-engineered CHO cell lines, rβ- 13 and CLF-8B2, were cultivated with the MC- 1 microcarrier culture system. The cell density could be enhanced by increasing the concentration of microcarrier. At a microcar... Genetically-engineered CHO cell lines, rβ- 13 and CLF-8B2, were cultivated with the MC- 1 microcarrier culture system. The cell density could be enhanced by increasing the concentration of microcarrier. At a microcarrier concentration of 10 mg/ml. the cell density could reach 4 to 5 × 106 cells/ml. It was shown that these cell lines would spontaneously release from the microcarrier to attach to and proliferate on fresh microcarriers. We were thus able to scale up cultivation using a simple method. i. e. by adding fresh microcarriers and medium directly into the culture system to about 2, 4 or 8 times the original volume. Using a perfusion culture system. we have successfully cultivated CLF-8B2 cells in a 2 L bioreactor for several weeks at medium perfusion rates of 0. 5 to 3working volumes. Prourokinase was stably secreted. 展开更多
关键词 MC -1 type microcarrier cho cell lines HuIFN-β
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三种病毒启动子在中国地鼠卵巢(CHO)细胞中表达活性的比较 被引量:9
13
作者 刘文军 杨芙蓉 +2 位作者 阮力 任贵方 朱既明 《病毒学报》 CAS CSCD 北大核心 1997年第2期164-168,共5页
三种病毒启动子在中国地鼠卵巢(CHO)细胞中表达活性的比较刘文军杨芙蓉阮力任贵方朱既明(中国预防医学科学院病毒学研究所北京100052)关键词CHOdhfr-细胞,启动子,瞬时表达,HBsAg基因,CAT基因目前大多... 三种病毒启动子在中国地鼠卵巢(CHO)细胞中表达活性的比较刘文军杨芙蓉阮力任贵方朱既明(中国预防医学科学院病毒学研究所北京100052)关键词CHOdhfr-细胞,启动子,瞬时表达,HBsAg基因,CAT基因目前大多数哺乳动物细胞表达载体中的启动子-... 展开更多
关键词 乙型肝炎 表面抗原 cho 病毒 启动子 基因表达
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低温细胞生存系统长期保存CHO细胞的初步研究 被引量:3
14
作者 徐波 向青 +4 位作者 徐梅 房青 李红艳 靳耀英 唐劲天 《中国康复理论与实践》 CSCD 2004年第11期652-653,共2页
目的验证基因工程细胞空间搭载系统在低温 ( 18℃ -3 0℃、无源等条件下保存细胞的可行性 ,观察此系统对生物工程细胞CHO(dhfr-)生长特性的影响。方法将CHO (dhfr-)生物工程细胞株在空间搭载系统中培养 2 5d后 ,利用光镜、MTT法、FCM分... 目的验证基因工程细胞空间搭载系统在低温 ( 18℃ -3 0℃、无源等条件下保存细胞的可行性 ,观察此系统对生物工程细胞CHO(dhfr-)生长特性的影响。方法将CHO (dhfr-)生物工程细胞株在空间搭载系统中培养 2 5d后 ,利用光镜、MTT法、FCM分析、3 H掺入法及染色体分析观察细胞生长特性。结果细胞低温培养 2 5d后 ,CHO(dhfr-)细胞呈多种形态 ;细胞周期变化差异不显著 ;染色体无断裂 ;细胞生长速度显著减慢 ;大分子生物合成显著增加。结论空间搭载系统搭载CHO(dhfr-)细胞进入空间后 ,虽然细胞产生了许多生理性变化 ,但能使CHO(dhfr-)细胞生存下来。利用空间搭载系统搭载细胞是完全可行的。 展开更多
关键词 低温 空间搭载系统 cho(dhfr^-)细胞 生长特性
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用定点整合系统表达抗基孔肯亚病毒人-鼠嵌合抗体的研究 被引量:1
15
作者 李建民 陈薇 +4 位作者 贾秀杰 安小平 李冰 樊英茹 童贻刚 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2005年第3期312-315,318,共5页
目的:构建含有FRT序列的CHO/dhfr-工程细胞株,并在此细胞株中用定点整合系统表达抗基孔肯亚病毒人鼠嵌合抗体。方法:首先克隆FRT序列与HBsAg的融合基因FRT-HBsAg,然后将FRT-HBsAg亚克隆到pCI neo的MCS中,构建表达载体pCI FRT-HBsAg。以... 目的:构建含有FRT序列的CHO/dhfr-工程细胞株,并在此细胞株中用定点整合系统表达抗基孔肯亚病毒人鼠嵌合抗体。方法:首先克隆FRT序列与HBsAg的融合基因FRT-HBsAg,然后将FRT-HBsAg亚克隆到pCI neo的MCS中,构建表达载体pCI FRT-HBsAg。以此载体转染CHO/dhfr-细胞,用1g/L的G418筛选抗性克隆。检测抗性克隆HBsAg的表达,筛选表达量高的克隆作为宿主细胞株,命名为CHO/dhfr-FRT+。将表达质粒pA FRTHFLF和pOG44以1∶9的质量比混合,取2μg转染CHO/dhfr-FRT+。转染48h后,换选择培养基(撤掉H、T)用96孔板进行克隆化,2wk后对长成的单克隆进行检测。筛选正确整合到CHO/dhfr-FRT+细胞中FRT位点的克隆,并不断提高MTX的浓度,进一步筛选表达量更高的克隆。在MTX的浓度为2×10-7mol/L时,获得稳定表达细胞株,其最后的表达量为5mg/L。对此细胞株扩大培养后,收集上清并纯化,以纯化的嵌合抗体进行SDS-PAGE及Westernblot和抗原结合活性的检测。结果:构建了高转录活性位点整合FRT序列的CHO/dhfr-细胞株,并在此细胞株中表达抗基孔肯亚病毒人鼠嵌合抗体,表达量为5mg/L。结论:构建了含有FRT序列的CHO/dhfr-工程细胞株,并在此细胞株中用定点整合系统表达抗基孔肯亚病毒人鼠嵌合抗体,为用此系统表达抗体分子和其他蛋白分子奠定了基础? 展开更多
关键词 定点整合 FRT cho/dhfr^-细胞 基孔肯亚病毒 嵌合抗体
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正交设计优化电转染CHO细胞的方法 被引量:1
16
作者 陆俭 李萍 +2 位作者 马亚茹 陈勇 蒋琳 《生物技术通讯》 CAS 2011年第5期713-716,共4页
目的:探讨细胞电穿孔转染的优化方法。方法:按照L9(34)正交表安排各因素水平的细胞电敏感性实验,以台盼蓝染色计数确定细胞存活率,最接近50%存活率为最优方案,根据最优方案将CHO-dhfr-细胞与DNA混匀电穿孔转染以验证正交设计结果。结果:... 目的:探讨细胞电穿孔转染的优化方法。方法:按照L9(34)正交表安排各因素水平的细胞电敏感性实验,以台盼蓝染色计数确定细胞存活率,最接近50%存活率为最优方案,根据最优方案将CHO-dhfr-细胞与DNA混匀电穿孔转染以验证正交设计结果。结果:CHO-dhfr-细胞电转染的优化参数为低离子强度Tris-Cl缓冲液、750 V/cm、50μF、电击2次、间隔1 min,各因素对转染的影响大小依次为缓冲液、电场强度、脉冲次数、电容。结论:确定了电穿孔法转染CHO-dhfr-细胞的方法,为进一步应用该细胞株表达重组蛋白打下了基础。 展开更多
关键词 电穿孔法 cho-dhfr-细胞 正交设计
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HBsAg真核表达载体的构建及其在CHO细胞中的表达 被引量:1
17
作者 张艳 时成波 +1 位作者 郭丽 范洪学 《中国实验诊断学》 2007年第10期1287-1289,共3页
目的构建HBsAg真核表达载体,转染CHO细胞并检测其表达。方法通过PCR法扩增出乙肝表面抗原的S基因和dhfr基因,分别克隆到T载体上,然后分别将S基因和dhfr基因克隆到pCI载体上,将pCI载体的CMV启动子替换为hEF-1α启动子。对新构建的pEF1-α... 目的构建HBsAg真核表达载体,转染CHO细胞并检测其表达。方法通过PCR法扩增出乙肝表面抗原的S基因和dhfr基因,分别克隆到T载体上,然后分别将S基因和dhfr基因克隆到pCI载体上,将pCI载体的CMV启动子替换为hEF-1α启动子。对新构建的pEF1-αS-dhfr真核表达载体进行酶切和测序鉴定。用脂质体法转染CHO(dhfr-)细胞,并用ELISA法检测HBsAg表达。结果hEF-1α启动子、S基因和dhfr基因经测序与Genbank报道一致。真核表达载体pEF1-αS-dhfr经酶切鉴定与预期一致。转染重组质粒后的CHO细胞成功表达了HBsAg。结论已成功构建了真核表达载体pEF1-αS-dhfr,为研究高效表达HBsAg奠定了良好的实验基础。 展开更多
关键词 真核表达载体 cho细胞 人延伸因子启动子 乙肝表面抗原 二氢叶酸还原酶基因
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GPI锚固型Met-RANTES真核表达载体的构建和表达
18
作者 李臻 夏峰 张远强 《中国生物工程杂志》 CAS CSCD 北大核心 2006年第6期6-11,共6页
目的:在仓鼠卵巢细胞(CHO细胞)中高效表达糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚定修饰的Met-RANTES融合蛋白,以研制新型免疫抑制分子GPI锚固型Met-RANTES。方法:构建真核表达载体PEF/GPI-Met-RANTES,利用电转化法转染CHO-DHFR-细胞,氨甲喋呤(MTX)筛选... 目的:在仓鼠卵巢细胞(CHO细胞)中高效表达糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚定修饰的Met-RANTES融合蛋白,以研制新型免疫抑制分子GPI锚固型Met-RANTES。方法:构建真核表达载体PEF/GPI-Met-RANTES,利用电转化法转染CHO-DHFR-细胞,氨甲喋呤(MTX)筛选抗性克隆。用流式细胞仪、细胞免疫荧光和免疫金标记电镜检测细胞膜上GPI锚固型Met-RANTES融合蛋白的表达情况。结果:构建了阅读框完整的GPI锚固型Met-RANTES嵌合分子,经测序是正确的,并在CHO-DHFR-细胞膜上稳定表达。结论:在CHO细胞表面高效表达GPI修饰的Met-RANTES融合蛋白,GPI锚固型Met-RANTES分子有可能作为新型的免疫抑制剂用于器官移植中,抑制移植排斥反应。 展开更多
关键词 GPI锚 Met-RANTES cho-dhfr-细胞 真核表达
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小鼠金属硫蛋白基因-I在CHO细胞中稳定表达及其在医疗方面的应用
19
作者 殷慎敏 李令媛 茹炳根 《北京大学学报(自然科学版)》 CSCD 北大核心 1996年第4期481-487,共7页
将小鼠的MT-Ⅰ基因插入pSV2-dhfr质粒的EcoRI位点,构建了具有SV40和MT双启动子并正向插入MT-Ⅰ基因的表达载体。用改良的磷酸钙/DNA沉淀法将表达载体导入CHO-dhfr-细胞内,用不含次黄嘌呤(H... 将小鼠的MT-Ⅰ基因插入pSV2-dhfr质粒的EcoRI位点,构建了具有SV40和MT双启动子并正向插入MT-Ⅰ基因的表达载体。用改良的磷酸钙/DNA沉淀法将表达载体导入CHO-dhfr-细胞内,用不含次黄嘌呤(H)和胸腺嘧啶(T)的选择培养基筛选出稳定表达MT阳性克隆D-22,经检测106细胞的MT表达量约为1.8μg,D-22细胞对Cd2+浓度抗性较之CHO-dhfr-细胞高14倍。为了研究金属硫蛋白对正常细胞所具有的保护作用,将不同浓度的顺铂分别处理无MT表达的CHO-dhfr-细胞和有MT表达的D-22细胞。实验发现顺铂对D-22细胞和CHO-dhfr-细胞50%生长抑制浓度(IC50)分别是0.145μmol/L和0.04μmol/L。上述研究表明MT对正常细胞有一定的保护作用,因而通过诱导正常细胞提高MT的表达量,同时使用MT阻断剂阻断肿瘤组织的MT合成。 展开更多
关键词 金属硫蛋白 细胞转染 基因表达 cho细胞 医疗
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表达含前S的乙肝病毒表面抗原重组CHO细胞株的建立和特性检测
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作者 刘新琼 颜华 王德彬 《华中农业大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2009年第4期390-393,共4页
为建立表达含前S基因乙肝病毒表面抗原的细胞株,将笔者所在实验室构建的表达含前S基因乙肝病毒表面抗原(HBsAg)的真核表达质粒共转染CHO/dhfr-细胞,通过筛选,获得可表达含前S基因乙肝病毒表面抗原的重组CHO细胞,然后进行亚克隆,用氨甲喋... 为建立表达含前S基因乙肝病毒表面抗原的细胞株,将笔者所在实验室构建的表达含前S基因乙肝病毒表面抗原(HBsAg)的真核表达质粒共转染CHO/dhfr-细胞,通过筛选,获得可表达含前S基因乙肝病毒表面抗原的重组CHO细胞,然后进行亚克隆,用氨甲喋呤(MTX)加压选择,以ELISA法检测目的蛋白表达量,筛选获得稳定表达目的蛋白的细胞株,并对其进行特性鉴定。最终获得了C10和A10两株稳定高表达含前S基因乙肝病毒表面抗原的细胞株。 展开更多
关键词 中国仓鼠卵巢/dhfr-细胞 二氢叶酸还原酶 转染 G-418 氨甲喋呤 含前S乙肝病毒表面抗原
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