汉黄芩素通过NRF2/HO-1信号途径诱导大鼠CIA-FLS细胞铁死亡

目的:探讨汉黄芩素(WOG)通过核因子E2相关因子2(NRF2)/血红素加氧酶1(HO-1)信号途径诱导胶原诱导性关节炎大鼠成纤维细胞样滑膜细胞(大鼠CIA-FLS细胞)铁死亡的机制。方法:将大鼠CIA-FLS细胞分为:对照组、低、中、高剂量(25、50和100μmol/L)汉黄芩素组、铁死亡抑制剂(LIP-1)组、LIP-1+高剂量汉黄芩素组、HO-1激动剂钴原卟啉(COPP)组和COPP+高剂量汉黄芩素组,CCK-8法检测细胞活力;结晶紫染色法检测细胞形态;检测氧化应激标志物谷胱甘肽(GSH)、丙二醛(MDA)和超氧化物歧化酶(SOD)的水平;DCFH-DA荧光探针检测细胞内活性氧(ROS)的含量,Western blot检测Kelch样ECH关联蛋白1(KEAP-1)、NRF2和HO-1蛋白表达水平。结果:与正常对照组相比,给予WOG处理后,大鼠CIA-FLS细胞活力显著下降(P<0.01),氧化应激水平显著上升(P<0.01),ROS含量显著增加(P<0.01),NRF2和HO-1蛋白表达水平显著下降(P<0.01),KEAP-1水平显著增加(P<0.01);与WOG组相比,LIP-1处理组的细胞活力显著上升(P<0.01),氧化应激水平显著下降(P<0.01),ROS含量显著减少(P<0.01);与WOG组相比,加入COPP后,NRF2和HO-1蛋白表达水平显著上升(P<0.01),KEAP-1水平显著下降(P<0.01)。结论:WOG能通过NRF2/HO-1信号途径,促进氧化应激来诱导大鼠CIA-FLS细胞铁死亡。

风湿宁胶囊含药血清干预对CIA-FLS细胞增殖及凋亡的影响

目的:探讨风湿宁胶囊(FSN)含药血清干预对CIA-FLS细胞增殖及凋亡的影响。方法:采用CCK-8法检测各组血清干预24、48、72 h后对CIA-FLS细胞增殖状态的影响;采用Annexin V-FITC/PI双染法通过流式细胞仪观察各组血清干预48 h后对CIA-FLS细胞早期和晚期凋亡情况的影响。结果:CCK-8法结果表明,在24 h,FSN各浓度(20%、10%和5%)含药血清干预对CIA-FLS细胞的增殖无抑制作用;在48 h,20%FSN含药血清和10%FSN含药血清干预对CIA-FLS细胞的增殖都表现出不同程度的抑制。在72 h,FSN各浓度(20%、10%和5%)含药血清对CIA-FLS细胞增殖均可见显著的抑制效果,其中20%风湿宁胶囊含药血清效果最好。Annexin V-FITC/PI双染检测结果表明,风湿宁胶囊含药血清各浓度(20%、10%和5%)组都不同程度地提高了细胞总凋亡率,其中20%风湿宁胶囊含药血清组对CIA-FLS细胞凋亡促进作用最强。结论:风湿宁胶囊含药血清对CIA-FLS细胞增殖的抑制及凋亡的促进可能是其治疗类风湿关节炎的机制之一。

风湿宁胶囊含药血清对JAK2/STAT3信号通路及相关细胞因子的影响

目的:探讨风湿宁(FSN)胶囊含药血清对JAK2/STAT3信号通路及相关细胞因子的影响。方法:采用Real-time PCR和Western blot技术分别从基因和蛋白的角度来观察各组CIA-FLS细胞中P-JAK2、PSTAT3及其负反馈调节因子SOCS1和SOCS3的含量;采用Real-time PCR技术分别对各组CIA-FLS细胞中VEGF和RANKL的表达情况进行检测。结果:Tofacitinib含药血清+IL-6组、FSN含药血清+IL-6组CIAFLS细胞JAK2、STAT3的mRNA含量和蛋白表达都明显下降(P<0.05),该通路相关细胞因子VEGF和RANKLmRNA的含量也明显减少(P<0.05)。20%FSN含药血清+IL-6组CIA-FLS细胞SOCS3mRNA含量和蛋白表达上升(P<0.05),10%FSN含药血清+IL-6组中VEGF和RANKLmRNA的含量不同程度的减少(P<0.05)。结论:风湿宁胶囊含药血清可能通过对CIA-FLS细胞JAK2/STAT3信号通路的抑制作用进而影响了相关细胞因子VEGF和RANKL的表达,这也可能是风湿宁胶囊能够改善类风湿关节炎血管翳形成和骨破坏的机制之一。

基于Fas/FasL介导的线粒体凋亡探讨枫杨总黄酮治疗类风湿关节炎的作用机制

目的:探讨枫杨总黄酮(PHSTF)通过Fas/FasL介导的线粒体凋亡治疗类风湿关节炎(RA)的可能机制。方法:体外培养胶原诱导型关节炎(CIA)-成纤维细胞样滑膜细胞(FLS),CCK-8检测PHSTF对细胞存活率的影响;流式细胞术检测PHSTF对细胞凋亡的影响;Western Blot检测Fas、FasL、Bax、Bcl-2、t-Bid、C-Caspase8、C-Caspase9、C-Caspase3蛋白表达,加入Fas抑制剂KR-33493后进一步检测PHSTF对相关蛋白表达的影响。体内实验采用Ⅱ型胶原诱导法构建CIA大鼠复制RA模型,设立Control组、Model组、PHSTF组、TG组,每组8只,评估大鼠关节炎指数(AI)和足趾肿胀度;ELISA检测血清肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素(IL)-1β、IL-6含量;HE染色观察膝关节病理学变化;Western Blot检测滑膜组织Fas/FasL介导的线粒体凋亡相关蛋白的表达。结果:体外实验显示,PHSTF能够诱导CIA-FLS细胞凋亡(P<0.01);与Control组比较,PHSTF各浓度组Fas、FasL、Bax、t-Bid、C-Caspase8、C-Caspase9、C-Caspase3蛋白表达均显著增加、抗凋亡蛋白Bcl-2表达显著降低(P<0.05,P<0.01);加入Fas抑制剂KR-33493干扰Fas信号通路后,逆转了Fas信号通路相关蛋白的表达。体内实验显示,与Model组比较,PHSTF、TG组AI评分和足趾肿胀度显著降低(P<0.05),膝关节病理变化得到改善,血清中TNF-α、IL-1β、IL-6含量显著降低(P<0.01);Fas、FasL、Bax、t-Bid、C-Caspase8、C-Caspase9、C-Caspase3蛋白表达均增加、Bcl-2蛋白表达显著降低(P<0.01)。结论:PHSTF能够通过激活Fas/FasL介导的线粒体凋亡,抑制CIA-FLS细胞增殖、促进凋亡,改善CIA大鼠关节炎表型,起到治疗RA的作用。