可溶性CD40配体对人B细胞淋巴瘤细胞系BJAB增殖、凋亡的影响及其机制

目的观察可溶性CD40配体(s CD40L)对人B细胞淋巴瘤细胞系BJAB增殖、凋亡的影响,并探讨其机制。方法培养BJAB细胞并将其分为实验组、阳性对照组、空白对照组。实验组分别加入0、1、2、3、4、5、6、7g/m L的s CD40L,空白对照组加入同量生理盐水,阳性对照组加入10 mol/L的地塞米松。用不同浓度为的s CD40L作用于BJAB细胞,在24、48、72 h用MTT法测算细胞增殖抑制率;应用流式细胞术观察凋亡细胞及不同周期细胞;采用Western blotting法检测细胞中的Bax、Bcl-2、Caspase-3蛋白。结果阳性对照组及实验组不同浓度s CD40L处理的细胞培养48、72 h后增殖抑制率高于培养24 h时(P均<0.05)。随着s CD40L作用浓度升高,实验组BJAB细胞增殖抑制率升高。实验组、阳性对照组G_1期细胞百分比增高,S期细胞百分比下降;实验组中,6 g/m L亚组G_1期细胞百分比高于2、4 g/m L亚组,S期细胞百分比低于2、4 g/m L亚组(P均<0.05)。实验组、阳性对照组细胞凋亡率高于空白对照组(P均<0.05);实验组中6 g/m L亚组细胞凋亡率低于阳性对照组(P<0.05)。实验组及阳性对照组细胞中Bax、Caspase-3蛋白相对表达量高于空白对照组,Bcl-2蛋白相对表达量低于空白对照组(P均<0.05)。结论 s CD40L可抑制BJAB细胞增殖、诱导其凋亡,机制可能与上调Bax、Caspase-3蛋白表达及下调Bcl-2蛋白表达和干扰细胞周期有关。

CD40配体诱导小鼠B淋巴瘤细胞分化抑制因子3下调表达的研究

目的：研究CD40配体（CD40L）对小鼠未成熟B淋巴瘤细胞（WEHI-231细胞）分化抑制因子3（Id3）表达的影响。方法：用RT-PCR技术从WEHI-231细胞总RNA中扩增小鼠Id3（mid3）cDNA，将其亚克隆至p3FLAG-CMV-10载体；以p3FLAG-Id3-CMV-10为模板，用PCR扩增3FLAG—Id3融合基因，将其亚克隆至逆转录病毒载体pMX—CITE／IRES—EGFP中；通过脂质体转染技术将重组逆转录病毒载体（pMX-3FLAG—Id3-EGFP）转染Phoenix-ecotropic包装细胞系；将pMX-3FLAG-Id3-EGFP逆转录病毒转导WEHI-231细胞，转导48h后的WEHI-231细胞与CD40L／NIH333和NIH333细胞共培养24～48h。转导细胞经有限稀释法建立ndd3基因稳定转染细胞系。mlar3基因稳定转染细胞与CD40L／NIH333和NIH333细胞共培养24h后，用Western blot法检测3FLAG-mid3融合蛋白的表达。结果：pMX-3FLAG-Id3-EGFP转导WEHI-231细胞后，EGFP阳性细胞比例随时间呈下降趋势；单独用培养液培养或与NIH333细胞共培养的pMX-3FLAG-Id3-EGFP／WEH1-231细胞，24～48h后，EGFP阳性细胞率呈逐渐下降趋势；而与CD40L／NIH333细胞共培养的pMX-3FLAG-Id3-EGFP／WEHI231细胞，EGFP阳性细胞率基本保持不变。稳定表达3FLAG-Id3融合蛋白的WEHI-231细胞与CD40L／NIH313和NIH333细胞共培养24h后，Western blot结果显示，CD40L刺激可明显抑制3FLAG—Id3-EGFP／WEHI-231中Id3的表达。结论：CD40L可能通过对Id3的降解而缓解Id3诱导的细胞生长抑制作用。

rhCD40L及阿司匹林对人I型胶原α_2(I)链启动子活性表达的影响

目的探讨rhCD40L及阿司匹林对人I型胶原α2(I)链启动子活性的作用。方法体外培养人血管平滑肌细胞(VSMCs),人Ⅰ型胶原α2(Ⅰ)链基因启动子重组质粒pCOLH22.4和pCOLH21.6扩增和酶切鉴定后,通过脂质体(Lipofectamin)转染VSMCs,rhCD40L刺激转染后细胞,ELISA检测CAT目的基因表达以及阿司匹林(100μmol/L)的影响。结果rhCD40L使CAT目的基因表达下降;阿司匹林可以增加CAT目的基因表达,并逆转rh-CD40L诱导的CAT目的基因表达下降(P<0.05)。结论阿司匹林上调人I型胶原启动子活性表达,并且逆转rh-CD40L对人I型胶原启动子活性的下调作用,可能是其抗动脉粥样硬化和稳定斑块的机制之一。

稳定表达sCD40L的CHO细胞系的建立和鉴定

目的:建立稳定表达sCD40L的CHO细胞系。方法:从含sCD40L的载体pDC316-sCD40L中,将sCD40L编码序列克隆入真核表达载体pIRES2-EGFP,获得重组质粒pIRES2-EGFP-sCD40L,酶切及测序鉴定。电穿孔转染CHO细胞,G418筛选抗性克隆,有限稀释法获取单克隆后扩大培养。流式细胞术、倒置荧光显微镜观察绿色荧光蛋白的表达;使用PCR、RT-PCR、ELISA方法分别从DNA、mRNA、蛋白水平对sCD40L的表达进行检测。Westernblotting检测CHO-sCD40L分泌的sCD40L与膜型CD40的结合;将CHO-sCD40L与MDA-MB-231细胞共孵育24h后,流式细胞术检测MDA-MB-231细胞表面分子Fas的表达变化;加入Fas激活性抗体(CH-11)后观察MDA-MB-231细胞的凋亡。结果:成功构建质粒pIRES2-EGFP-sCD40L,转染CHO细胞后经克隆化培养获得稳定表达sCD40L的细胞系CHO-sCD40L。流式细胞术、倒置荧光显微镜检测绿色荧光蛋白表达高达90%以上;PCR检测证实sCD40L基因整合入细胞基因组DNA;RT-PCR检测到sCD40LmRNA的转录;ELISA法检测到细胞培养上清中有sCD40L蛋白表达,高达(4.5±2.1)ng/ml。Western blotting证实CHO-sCD40L分泌的sCD40L可与膜型CD40结合。CHO-sCD40L与MDA-MB-231细胞共培养后,MDA-MB-231细胞表面Fas表达由(3.0±1.02)%升高到(34.8±8.75)%;加入CH-1124h后,凋亡率由(5.4±1.32)%提高到(20.7±5.24)%(P<0.01)。结论:成功获得稳定表达sCD40L的CHO细胞系,为研究CD40/CD40L途径在肿瘤免疫治疗中的应用提供了有用的工具。

急性冠脉综合征患者高表达的CD40L和炎症因子相关性

目的检测急性冠脉综合征（ACS）患者CD4^＋T细胞CD40L的表达率、其血清可溶性CD40配体（sCD40L）和高敏C反应蛋白（hsCRP）、细胞间黏附分子-1（ICAM-1）、血管细胞黏附分子-1（VCAM-1）的浓度，分析CD40L（sCD40L）与炎症因子的相关性，探讨CD40／CD40L在ACS发病中的作用及可能途径。方法采用前瞻性研究方法，选取2006-10-2007-4中山大学附属第一医院急诊科、心血管医学部冠心病患者32例，包括稳定性心绞痛（SAP）7例、不稳定性心绞痛（UAP）14例、急性心肌梗死（AMI）11例。正常对照组（CON）为与患者年龄、性别相匹配的健康志愿者8例。所有受试者均排除感染、肿瘤、风湿、肝肾功能不全，未使用类固醇和免疫抑制剂等。流式细胞分析术（FCM）检测CD4^＋T细胞表达CINOL的阳性细胞率，ELISA法检测血清sCD40L、ICAM-1和VCAM-1浓度，免疫比浊法检测血清hsCRP浓度。所有资料使用SPSS11．0进行统计学分析。结果AMI、UAP、SAP、CON组CD4^＋T细胞中表达CD40L的阳性细胞率（％）分别为8．60±3．02、3．24±1．13、2．18±1．80、0．59±0．18，AMI组显著高于其他3组（P〈0．05），UAP组亦显著高于CON组（P〈0．05）；4组血清sCD40L浓度分别为14．47±8．00、8．06±6．96、7．32±3．58、4．48±1．49（ng／mL），AMI组明显高于其他3组（P〈0．05）；4组血清hsCRP浓度分别为20．30±7．57、14．04±8．03、3．78±4．99、0．93±0．77（mg／L），AMI组显著高于其他3组（P〈0．05），UAP组亦显著高于SAP组与CON组（P〈0．05）；4组血清ICAM-1浓度分别为418．09±222．19、212．86±128．43、165．04±32．12、108．62±62．27（ng／mL），ANI组显著高于其他3组（均P〈0．05），UAP组亦高于CON组（P〈0．05）；4组血清VCAM-1浓度分别为5540．02±2614．65、3760．95±1915．01、4167．27±2084．48、2405．65±870．45（ng／mL），AMI组显著高于CON组（P〈0．01）；AMI组CD4^＋T细胞中表达CD40L的阳性细胞率与VCAM-1呈明显正相关性（r=0．730，P=0．011），其血清sCD40L与hsCRP、ICAM-1、VCAM-1呈明显正相关性（r=0．677，P=0．011；r=0．901，P=0．000；r=0．714，P=0．014）。结论急性冠脉综合征患者CIN^＋T细胞CINOL的表达率和血清sCINOL浓度升高，且与血清hsCRP、ICAN-1、VCAN-1呈明显正相关；在ACS发生中起作用，此和hsCRP、ICAN-1、VCAN-1等有关，而CD40L/sCINOL可望作为冠心病危险性的预测因子。

CD40-CD40L 配基化下调人伯基特淋巴瘤细胞生存素表达和介导细胞凋亡

目的探讨 srhCD40L 介导 CD40配基化对人类伯基特(Burkitt)淋巴瘤 CA46细胞生物学行为影响及其可能的分子机制。方法应用四甲基偶氮唑盐比色法、细胞周期分析法、膜联蛋白-V凋亡检测法(Annexin-V)、TDT 酶介导的缺口末端标记法(terminal deoxynucleotide mediated nick endlabeling,TUNEL),检测 srhCD40L 介导 CD40配基化,对人类 Burkitt 淋巴瘤 CA46细胞增殖、细胞周期和细胞凋亡等细胞生物学行为的影响;应用半定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和免疫印迹法检测 srhCD40L 介导 CD40 配基化对人类 Burkitt 淋巴瘤 CA46细胞的生存素基因和蛋白表达的影响。结果 CD40在人类 Burkitt 淋巴瘤 CA46细胞中高表达;srhCD40L 介导 CD40配基化诱导 CA46细胞发生同型聚集生长、抑制细胞增殖和诱导细胞凋亡。对细胞周期的影响为 S 期进入 G_2/M 期受阻。srhCD40L 介导 CD40配基化作用可引起 CA46细胞的生存素基因和蛋白表达下调。结论srhCD40L 介导 CD40配基化可抑制 Burkitt 淋巴瘤 CA46细胞增殖、诱导其凋亡;生存素基因与蛋白可能是参与 srhCD40L 介导 CD40配基化抑制 CA46细胞增殖和诱导凋亡的分子机制之一。