靶向CK1α基因shRNA表达载体的构建及其对A549细胞增殖的影响

通过RNA干扰实验沉默酪蛋白激酶1α(Casein Kinase1α,CK1α)基因,探讨其对肺癌细胞A549生长增殖的影响.首先构建3个针对CK1α基因不同位点的短发夹表达载体pGenesil-CK1α-S1、pGenesil-CK1α-S2、pGen-esil-CK1α-S3和一个无义错配载体pGenesil-NK,分别转染A549细胞,用G418筛选出阳性克隆,得到A549-S1、A549-S2、A549-S3及A549-NK细胞株.再通过RT-PCR和W estern b lotting方法,分别检测了CK1α基因的mRNA和蛋白的表达情况.比对A549-NK,A549-S1、A549-S2及A549-S3 mRNA水平的抑制率分别为84.3%、57.9%和61.8%(P<0.001);蛋白质水平的抑制率分别为78.4%、51.3%和59.9%(P<0.001).选择干扰效率较好的A549-S1细胞进行后续实验.细胞计数绘制生长曲线、CCK-8法观察细胞增殖状况和流式细胞仪检测细胞所处周期时相来分析转染CK1α基因shRNA表达载体对A549细胞生长增殖的影响.实验结果显示,A549-S1与A549和A549-NK两对照组的平均值比较,细胞计数抑制率为(37.7±2.2)%(P<0.01);CCK-8抑制率为(26.2±1.5)%(P<0.05);S期减少(75.0±4.0)%(P<0.01);G2/M期减少(45.2±5.4)%(P<0.05).因此,转染CK1α基因shRNA表达载体可导致CK1α基因的沉默,明显抑制A549细胞的生长和增殖.

人CSNK1A1基因两种转录变异体CK1αLS与CK1αS在细胞株中的表达

目的:分析CSNK1A1基因两种转录变异体CK1αLS和CK1αS在人正常细胞株和人肿瘤细胞株中的表达及在肿瘤发生发展中的作用。方法:RT-PCR法半定量检测不同细胞株中CSNK1A1基因的CK1αLS与CK1αS的mRNA表达水平。结果:36个细胞株中有32个细胞株存在CK1αLS与CK1αS的表达差异。在胚肾细胞293A、2株肺纤维细胞(MRC-5与HLF)、2株肺腺癌细胞(A549与SPC-A1)、巨细胞肺癌细胞HLAmp、小细胞肺癌细胞H446、鼻咽高分化鳞癌细胞CNE1、胃癌细胞SGC7901、骨肉瘤细胞MG-63以及3株白血病细胞(HL60、MOLT-4与Daudi)中,CK1αLS比CK1αS mRNA表达量少(P<0.05);而在肺泡细胞癌细胞H1650、肺鳞癌细胞L78、大细胞肺癌细胞H460、鼻咽低分化鳞癌细胞CNE2、3株乳腺癌细胞(Bcap-37、MDA-MB-435S与MCF-7)、2株胰腺癌细胞(BxPC-3与Panc-1)、肝细胞L02、肝癌细胞HepG2、胃上皮细胞GES-1、胃癌细胞MGC-803、结肠腺癌细胞SW620、前列腺癌细胞DU145、宫颈癌细胞Hela、卵巢癌细胞HO8910、纤维肉瘤细胞HT1080、神经胶质瘤细胞U251、脐静脉内皮细胞ECV304,CK1αLS比CK1αS mRNA表达量多(P<0.05)。胰腺癌细胞Panc-1高表达CK1αLS,低表达CK1αS;胃癌细胞SGC7901低表达CK1αLS,高表达CK1αS;结肠腺癌细胞SW620 CK1αLS与CK1αS两者表达较低;肺泡细胞癌细胞H1650 CK1αLS与CK1αS两者表达较高。结论:CK1αLS和CK1αS的mRNA表达存在差异,可能与肿瘤细胞的来源和分化程度有关。

CK1α表达与糖尿病心肌病细胞自噬、脂质堆积、细胞凋亡的关系研究

目的探究CK1α表达与糖尿病心肌病细胞自噬、脂质堆积、细胞凋亡的关系。方法构建新生心肌细胞(NCM)脂毒性模型以及2型糖尿病雄性db/db小鼠模型分别进行体外研究以及体内研究,体外研究中将心肌细胞脂毒性模型分为腺病毒介导CK1α基因高表达组、阴性对照组、CRISPR/Cas9介导CK1α基因敲除组,体内研究的20只2型糖尿病雄性db/db小鼠模型分为CK1α过表达db/db组、注射对照组,并选取10只C57BL/Ks正常小鼠纳入正常小鼠组,对比各组的细胞自噬、脂质堆积、细胞凋亡指标差异。结果⑴Beclin-1蛋白主要在胞浆及细胞核中分布,阴性对照组的CK1α、Beclin-1蛋白、mRNA比3MA组高(P<0.05);⑵腺病毒介导CK1α基因高表达组的CK1α、Beclin-1蛋白、mRNA、Beclin-1蛋白绿色荧光强度最高,其次是阴性对照组、CRISPR/Cas9介导CK1α基因敲除组(P<0.05);⑶腺病毒介导CK1α基因高表达组的脂滴数量、二酰甘油及神经酰胺含量、细胞凋亡水平最低,其次是阴性对照组、CRISPR/Cas9介导CK1α基因敲除组(P<0.05);⑷CK1α过表达db/db组的LVIDd、LVIDs最低,FS、EF%水平更高,其次是正常小鼠组、注射对照组(P<0.05);⑸CK1α过表达db/db组具有最低的脂滴数量、二酰甘油及神经酰胺含量、细胞凋亡水平,其次是正常小鼠组、注射对照组(P<0.05);⑹CK1α过表达db/db组中CK1α、Beclin-1蛋白、mRNA表达水平最高,其次是正常小鼠组、注射对照组(P<0.05)。结论CK1α表达高表达会增强细胞自噬,CK1α表达可通过增强自噬能力途径改善糖尿病心肌病的脂质沉积、抑制细胞凋亡以及改善心功能的作用,可将CK1α与细胞自噬作为后续糖尿病心肌病治疗的新方向。

CKS1B在肺癌耐药机制中的研究进展

肺癌是全球常见的恶性肿瘤之一,极大地威胁着人们的健康和生命。化疗仍然是大部分肺癌晚期患者的主要治疗方法,但是耐药是治疗失败的主要原因,如何克服肿瘤耐药是今后研究的方向,CDC28蛋白激酶调节亚基1B(CKS1B)是CKS家族的一员,可与CDK催化亚基结合,调节细胞周期功能。近年来研究发现,CKS1B在多种肿瘤中是一种促癌因子,可促进肿瘤的发生,并且与患者预后不良密切相关。本文综述了CKS1B对肺癌细胞的影响机制及作为治疗靶点的最新研究。

circ-RBM33靶向miR-383-3p/CKS1B轴抑制鼻咽癌细胞的增殖和转移

目的:探究circ-RBM33能否靶向miR-383-3p/CKS1B轴抑制鼻咽癌细胞的增殖和侵袭。方法:qRT-PCR检测CNE1和HNEpC细胞中circ-RBM33、miR-383-3p表达。将CNE1细胞随机分为si-NC组、si-RBM33组、miR-NC组、miR-383-3p组和si-RBM33+anti-miR-383-3p组。分别检测细胞增殖(CCK-8法)、侵袭(Transwell法)和迁移(划痕实验)及细胞中CKS1B蛋白表达(蛋白质印迹法);荧光素酶活性实验检测circ-RBM33和miR-383-3p/CKS1B的靶向关系。结果:人鼻咽癌细胞CNE1中circ-RBM33相对表达量高于人鼻黏膜上皮细胞HNEpC,miR-383-3p相对表达量低于人鼻黏膜上皮细胞HNEpC(P<0.05)。si-RBM33组CNE1细胞中circ-RBM3相对表达量、细胞存活率、细胞侵袭数目、细划痕愈合率及细胞中CKS1B蛋白表达均低于si-NC组(P<0.05);si-RBM33+anti-miR-383-3p组CNE1细胞存活率、细胞侵袭数目、细胞划痕愈合率及细胞中CKS1B蛋白表达均高于si-RBM33组(P<0.05)。miR-383-3p组CNE1细胞中miR-383-3p相对表达量明显增加,细胞存活率、细胞侵袭数目、细划痕愈合率及细胞中CKS1B蛋白表达均低于miR-NC组(P<0.05)。转染WT-circ-RBM33/CKS1B时miR-383-3p组荧光素酶活性明显低于miR-NC组(P<0.0001)。结论:敲减circ-RBM33可能通过上调miR-383-3p表达,进而抑制CKS1B表达来抑制鼻咽癌细胞的增殖、侵袭和迁移。

双壳贝类CK1基因家族的鉴定及表达分析

酪蛋白激酶1 (CK1)是一种重要的蛋白激酶家族,其在DNA损伤应答和修复、细胞增殖和凋亡、胚胎发育和稳态等重要的生物学过程中都具有复杂多样的调控作用。为了理解CK1基因家族在双壳贝类中的特征、进化及生物学功能,实验采用比较基因组学及生物信息学的方法对双壳贝类CK1基因家族进行了鉴定分析,通过虾夷扇贝高温应激实验,研究了CK1基因家族在高温应激时的表达规律。结果显示,在虾夷扇贝、栉孔扇贝、长牡蛎与侏儒蛤中均存在CK1α,CK1αlike,CK1δ,CK1γ3,并发现CK1ε,CK1γ1,CK1γ2在双壳贝类中发生了丢失。时空表达分析发现,双壳贝类CK1基因均在胚胎发育早期集中表达,并以多细胞/囊胚期为界呈现出母源/合子特异性表达模式。CK1为关键基因的基因共表达模块显著富集在错配修复、核苷酸剪切修复等相关通路上,暗示了CK1基因在双壳贝类胚胎发育过程中参与调控DNA损伤修复过程,从而维持早期胚胎发育时的基因组稳定性。双壳贝类CK1基因在成体中呈现组织特异的表达模式,主要在鳃和雄性性腺中具有相对较高的表达量。虾夷扇贝受到高温应激后,其鳃中PyCK1α, PyCK1αlike和PyCK1δ在前3 h显著上调,但在12 h后趋于下调,而PyCK1γ3在高温应激不同时间点均表现出下降趋势,表明双壳贝类CK1基因参与响应高温应激反应。此项研究有助于理解双壳贝类CK1基因的功能和进化,为解析双壳贝类胚胎发育稳态维持和应激调节机制提供理论基础。

胃癌中Cks1、p27^(Kip1)和Skp2蛋白的表达

目的探讨Cks1在胃癌发生及其在Skp2调节p27Kip1降解过程中的作用。方法应用流式细胞术测定正常胃粘膜和胃癌组织中Cks1、p27Kip1、Skp2蛋白表达。结果胃癌组织中Cks1、Skp2表达明显高于正常胃粘膜(χ2=22.69,P<0.05;χ2=13.42,P<0.05),而p27Kip1表达则低于正常胃粘膜(χ2=14.83,P<0.05)。胃癌中Cks1、Skp2表达与p27Kip1表达呈负相关(r=-0.649,P<0.05;r=-0.732,P<0.05);而Cks1蛋白表达与Skp2蛋白缺乏相关性(P>0.05)。胃癌中Cks1的表达与肿瘤分化程度相关(χ2=5.05,P<0.05),而与肿瘤浸润深度、淋巴结转移及临床分期不相关(P>0.05)。结论Cks1可能参与了胃癌的发生;胃癌中Cks1可能参与了Skp2调节p27Kip1泛素化降解过程。

拟南芥CK1A基因功能初步研究

利用RT-PCR方法从拟南芥中分离了1个CK基因家族成员CK1A,该基因的ORF全长2112bp,编码一条703个氨基酸残基的多肽。构建了CK1A基因的植物表达载体35S:GFP:CK1A,采用基因枪法进行的洋葱表皮细胞GFP瞬时表达实验表明,荧光信号主要分布在细胞核上,显示CK1A基因的产物可能在细胞核上发挥作用。半定量RT-PCR分析表明:CK1A基因在花中表达量最大,其次是茎和根,在叶和叶柄中表达量较弱。蓝光使CK1A基因的表达升高,12h时表达量明显增加,24h时表达量下降。酵母双杂交结果显示CK1A蛋白在蓝光下能与CRY2蛋白发生相互作用,暗示CK1A基因可能参与拟南芥的蓝光信号传导途径。

胃腺癌组织中Cks1和p27^(kip1)表达的关系及其预后价值

目的探讨胃腺癌组织中Cks1和p27kip1的表达关系及对预后的判断价值。方法应用流式细胞术检测97例胃腺癌标本和48例正常胃黏膜组织中Cks1和p27kipl的表达,分析二者在不同临床特征中表达差别及预后价值。结果胃腺癌Cks1和p27kip1表达量明显高于正常胃黏膜组织,二者表达与胃腺癌浸润深度、TNM分期、增殖细胞核抗原(PCNA)表达及淋巴结转移有关,胃腺癌Cks1和p27kip1表达呈负相关,生存分析显示Cks1和p27kip1表达与胃腺癌患者预后有关。结论胃腺癌Cks1和p27kip1蛋白异常表达,二者可能有协同作用,对胃腺癌进展有一定促进作用,二者联合检测可能有助于判断患者预后。

CKS1和p27在乳腺癌中的表达及其意义

目的探讨CKS1和p27在乳腺癌中的表达情况及其临床意义。方法应用免疫组织化学SP法检测149例乳腺癌患者组织标本中CKS1和p27的表达水平,结合临床病理资料进行统计学分析。结果乳腺癌组织中CKS1的表达与淋巴结转移和临床分期有统计学意义(P<0.05)。p27的表达与淋巴结转移显著负相关(P<0.05),与临床分期和肿瘤分化程度无相关性。多因素分析发现临床分期(P<0.01)、淋巴结转移(P<0.01)、CKS1(P<0.01)和p27(P<0.01)的表达对预后的影响有统计学意义。CKS1与p27表达呈显著负相关(P<0.05)。结论CKS1和p27可能在乳腺癌的发生发展中发挥重要的作用,二者将来可能作为乳腺癌治疗的靶点之一。

乳腺癌组织中CKS1和CyclinD1的表达及相关分析

目的:探讨细胞周期蛋白依赖性激酶调节亚基1(cyclin kinase subunit1,CKS1)和细胞周期蛋白D1(CyclinD1)在乳腺癌组织的表达及意义。方法:采用免疫组化SP法检测105例乳腺癌组织中CKS1和CyclinD1的表达,并同时检测100例乳腺纤维腺瘤作为对照,分析其在乳腺癌组织中的表达及临床意义。结果:CKS1和CyclinD1在乳腺癌组织中的阳性率分别为80.9%(85/105)和85.7%(90/105),在乳腺纤维腺瘤中的阳性率分别为22%(22/100)和19%(19/100)。乳腺癌中两基因蛋白的阳性表达与淋巴管侵犯、淋巴结转移有关;乳腺癌中两基因蛋白的阳性表达均明显高于乳腺纤维腺瘤(P<0.05);乳腺癌组织中CKS1与CyclinD1的阳性表达呈正相关(r=0.677,P<0.05)。结论:CKS1和CyclinD1在乳腺癌组织中的表达较对照组乳腺纤维腺瘤明显升高,并且与淋巴管侵犯、淋巴结转移呈正相关,提示检测2种蛋白的表达对乳腺癌的临床治疗及预后预测具有一定的意义。

结直肠癌中Cks1,P27^(Kip1)和Skp2蛋白的表达

目的:探讨Cks1在结直肠癌发生及其在Skp2调节P27K ip1降解过程中的作用.方法:应用流式细胞术测定正常结直肠黏膜、结直肠腺瘤和结直肠癌组织中Cks1,P27K ip1和Skp2蛋白的表达.结果:由正常结直肠黏膜、结直肠腺瘤到结直肠癌Cks1,Skp2表达呈上升趋势(P<0.05),P27K ip1表达呈下降趋势(P<0.05).结直肠癌中Cks1,Skp2表达与P27K ip1表达呈负相关(r=-0.752,P<0.05;r=-0.746,P<0.05);Cks1与Skp2呈正相关(r=0.845,P<0.05).结直肠癌中Cks1的表达与肿瘤分化程度相关(P<0.05),而与淋巴结转移及Dukes分期不相关(P>0.05).结论:Cks1可能参与了结直肠癌的发生;结直肠癌中Cks1可能参与了Skp2调节P27Kip1泛素化降解过程.

胃癌中Cks1、P27^(Kip1)、Skp2蛋白表达相关性及其意义

目的:探讨Cks1在胃癌发生及Skp2调节P27Kip1降解过程中的作用。方法:应用流式细胞术检测正常胃黏膜、胃不典型增生组织及胃癌组织中Cks1、P27Kip1、Skp2蛋白的表达。结果:由正常胃黏膜、胃不典型增生组织到胃癌中Cks1、Skp2的表达均呈上升趋势(P<0.05),P27Kip1表达则呈下降趋势(P<0.05)。胃癌中Cks1、Skp2表达均与P27Kip1表达呈负相关(r=-0.649,P<0.05;r=-0.732,P<0.05);而Cks1蛋白表达与Skp2蛋白无相关性(P>0.05)。胃癌中Cks1表达与肿瘤分化程度相关(P<0.05),而与肿瘤浸润深度、淋巴结转移及临床分期不相关(P>0.05)。结论:Cks1可能参与胃癌的发生;胃癌中Cks1可能参与Skp2调节P27Kip1泛素化的降解过程。

血清中巨CK1、巨CK2和CK-BB的临床意义

血清中巨ＣＫ１、巨ＣＫ２和ＣＫ－ＢＢ的临床意义李小冬吴杰许绍辉作者单位：２００００３上海，第二军医大学长征医院ＣＫ－ＭＢ测定作为诊断急性心肌梗死或心肌坏死的特异性指标，已广为临床和检验界所关注，随着ＣＫ－ＭＢ测定的频率增加，在血清中发现巨ＣＫ１、巨Ｃ...

CK1δ与COX-2在食管鳞状细胞癌的表达及其意义

目的:探讨CK1δ与COX-2蛋白在食管鳞状细胞癌中的表达与食管癌临床病理特征之间的关系。方法:用免疫组织化学方法(SP法)检测了63例食管鳞状细胞癌手术切除的癌组织、癌旁组织(30例正常食管上皮、19例轻度不典型增生、14例重度不典型增生组织)中的CK1δ与COX-2的蛋白的表达。并采用流式细胞术对其中随机选取的40例癌组织、18例轻度不典型增生组织、12例重度不典型增生组织和20例正常食管上皮组织进行上述两种蛋白的定量分析,采用SPSS 11.5软件进行统计学处理。结果:在正常食管上皮组织中CK1δ和COX-2蛋白的表达显著低于轻度不典型增生组织、重度不典型增生组织和癌组织(P<0.01),轻度不典型增生组织显著低于癌组织(P<0.01),轻度不典型增生组织与重度不典型增生组织比较差异无显著(P>0.05),重度不典型增生组织和癌组织的比较差异无显著性(P>0.05)。在癌组织中,淋巴结转移组中CK1δ蛋白的表达显著高于无淋巴结转移组(P<0.01),CK1δ蛋白的表达与分化程度和有无纤维膜的侵及无关(P>0.05);淋巴结转移组中COX-2蛋白的表达显著高于无淋巴结转移组(P<0.01),有纤维膜侵及组中COX-2蛋白的表达显著高于无纤维膜侵及组(P<0.01),COX-2蛋白的表达与分化程度无关(P>0.05)。在食管鳞癌组织中CK1δ蛋白与COX-2蛋白之间呈显著正相关(r=0.482,P<0.01)。结论:CK1δ、COX-2蛋白的异常表达可能共同参与了食管鳞癌的发生、发展与转移,有望成为评价食管癌恶性程度和转移的指标。

DDX3和CK1ε在SOD1-G93A突变的ALS转基因小鼠纹状体的表达

目的:检测DDX3和CK1ε在SOD1-G93A突变的ALS转基因小鼠纹状体的表达变化,探讨其在ALS纹状体病变中的作用,为ALS研究提供新的实验依据。方法:将发病早期、中期和晚期(即95 d、108 d和122 d)的成年野生型小鼠和SOD1-G93A突变型ALS转基因小鼠分别处死取材,运用免疫荧光技术对小鼠纹状体内DDX3和CK1ε的表达水平进行检测,运用RT-PCR技术对小鼠纹状体内DDX3和CK1ε的m RNA水平进行检测,运用Western Blot行蛋白水平变化检测。结果:野生型小鼠和SOD1-G93A突变型转基因小鼠纹状体中均可检测到DDX3和CK1ε阳性细胞。DDX3和CK1ε在神经元表达,但在星形胶质细胞不表达。在发病的中期和晚期,DDX3在ALS转基因小鼠纹状体中的m RNA和蛋白表达与野生型鼠相比均升高。CK1εm RNA在ALS发病的早期不变化,在中期、晚期较野生型鼠降低;而在ALS发病的早期转基因小鼠纹状体中CK1ε蛋白表达量较野生型鼠升高,在中期、晚期降低。结论:DDX3和CK1ε在SOD1-G93A突变的ALS转基因小鼠纹状体中表达异常与ALS纹状体的病变密切相关。

CKS1 siRNA对人舌癌Tca8113细胞中CKS1蛋白的抑制作用

目的探讨CKS1 siRNA对人舌鳞状细胞癌Tca8113细胞中CKS1蛋白的干扰作用。方法设计特异性CKS1插入序列,转入Tca8113细胞,应用免疫组化、RT-PCR、Western印迹检测Tca8113细胞中CKS1蛋白的表达。结果 CKS1 siRNA成功导入并抑制了Tca8113细胞中CKS1蛋白的表达(P<0.05)。结论 CKS1 siRNA能抑制Tca8113细胞中CKS1蛋白的表达,应用CKS1 siRNA治疗舌癌具有可行性。

慢性紫外线损伤小鼠模型皮肤角质形成细胞中CK1和CK10的表达研究

目的:观察慢性紫外线(UV)损伤对小鼠角质形成细胞(KC)角蛋白(CK)1和CK10表达的影响。方法:将实验小鼠随机分为空白对照组(20只)和UV损伤组(20只),采用UV光疗仪模拟日光中的长波紫外线(UVA)和中波紫外线(UVB)照射实验小鼠。照射从最小红斑量起始,UVB为0.07 J/cm^2,UVA为0.7 J/cm^2;每日1次,每周5 d,每周增加0.5个红斑量,连续照射9周,UVB累计照射剂量达9.45 J/cm^2,UVA累计照射剂量达94.5 J/cm^2。通过苏木精-伊红(HE)染色和间苯二酚-碱性品红染色(Weigert染色法)确定皮肤损伤,通过免疫组化方法分别对照射前(W0)、后(W9)CK1和CK10的表达进行检测。应用配对t检验和独立样本t检验对相关数据进行统计分析。结果:空白对照组小鼠W0及W9时,CK1和CK10的表达差异均无统计学意义(P均>0.05)。UV损伤组小鼠W0和W9时,CK1和CK10的表达差异均有统计学意义(P均<0.05)。且UV损伤组小鼠CK1和CK10的表达呈明显的定位改变。结论:多次UV照射能导致小鼠模型中CK1和CK10的表达明显上调且定位异常。

多发性骨髓瘤细胞中c-myc介导的CKS1B转录调控的研究

目的以人多发性骨髓瘤细胞株XG1、XG7为研究对象,探讨原癌基因c-myc介导的CKS1B转录调控机制。方法构建c-myc表达质粒和CKS1B启动子报告质粒,转染多发性骨髓瘤细胞XG1及XG7,应用荧光素酶报告基因试验检测c-myc对CKS1B启动子活性的影响;再采用RNA干扰技术构建c-myc-shRNA载体,转染XG1及XG7细胞株,Western免疫印迹测定CKS1B蛋白表达水平的改变。结果荧光素酶报告基因试验显示,对照组相对荧光素酶活性为0.046±0.052,XG1-CKS1Bpro组为0.159±0.067,XG1-CKS1Bpro+c-myc组为0.656±0.086,3组间存在统计学差异(P<0.05)。XG7-CKS1Bpro组相对荧光素酶活性为0.162±0.081,XG7-CKS1Bpro+c-myc组为0.663±0.077,3组间存在统计学差异(P<0.05)。在XG1、XG7细胞内c-myc均可转录激活CKS1B启动子活性。2组细胞株中,shRNA干扰沉默c-myc基因表达后CKS1B蛋白水平均明显下调。结论 c-myc介导了CKS1B基因转录调控,c-myc在多发性骨髓瘤的发病与预后中可能具有重要作用。