CKIP-1对骨髓间充质干细胞体外增殖和分化能力的影响

目的:探讨CKIP-1基因对小鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)的增殖和分化能力的调控。方法:选择CKIP-1基因敲除型小鼠(KO)和野生型C57小鼠(WT),采用全骨髓贴壁法培养BMSCs,取第3代BMSCs,分为KO组和WT组,分别采用成骨及成脂诱导液对细胞进行诱导培养,MTT法检测细胞增殖,流式细胞仪检测目的细胞表面标记分子,用ALP染色、茜素红染色、油红O染色分别对细胞成骨及成脂能力做定量分析。结果:2种细胞增殖和干细胞分子表达相似;成骨诱导后ALP染色显示,KO组的细胞染色的阳性率要大于WT组。茜素红染色观察显示KO组的矿化结节要多于WT组;油红O染色显示KO组细胞的脂质沉淀量大于WT组。结论:CKIP-1基因缺失可以使BMSCs成骨及成脂分化能力增强,对其增殖影响不明显。

CKIP-1、p-Akt在大肠癌组织中的表达及意义

目的研究CKIP-1与大肠癌的发生发展、预后的关系及与PI3K/Akt通路的相关性,为大肠癌及分子靶向治疗提供可能的靶点。方法收集大肠癌患者手术标本,通过免疫组化方法检测CKIP-1蛋白、p-Akt蛋白在大肠癌组织中的表达;分析CKIP-1的表达与大肠癌临床病理参数、p-Akt表达的相关性。结果 CKIP-1蛋白主要位于胞质及包膜上,部分位于胞核;CKIP-1蛋白在大肠癌组织中的阳性表达率显著低于癌旁正常组织;CKIP-1在腺瘤组织中的表达率显著低于癌旁正常组织。p-Akt阳性染色大部分定位于胞核;少部分也定位于胞质;p-Akt在大肠癌组织中的表达明显高于腺瘤组织,p-Akt在腺瘤组织中的表达明显高于癌旁正常组织,3者均具有显著性差异。CKIP-1的表达与大肠癌的分化程度显著相关,p-Akt的表达与大肠癌的分化程度、临床分期显著相关。在大肠癌中,CKIP-1蛋白的表达与p-Akt蛋白的表达呈负相关。结论 CKIP-1可能参与了大肠癌的发生发展,并可能通过下调PI3K/Akt介导的细胞信号转导通路发挥作用。

CKIP-1:一种新型的凋亡促进因子

酪蛋白激酶2相互作用蛋白1(caseinkinase2interactionprotein1,CKIP-1)是近年来发现的一种重要分子,它通过与其他分子的相互作用在许多细胞行为中都发挥着重要的作用。最新研究发现,CKIP-1还具有促进细胞凋亡的作用。

MicroRNA-20a通过调节CKIP-1促进小鼠C3H/10T1/2成骨分化

目的:研究microRNA-20a(miR-20a)对小鼠C3H/10T1/2细胞成骨分化作用的影响及其调控机制。方法:对贴壁培养的小鼠C3H/10T1/2细胞成骨诱导不同时间,ALP染色及应用qRT-PCR验证其诱导结果,同时观察MiR-20a在诱导过程中表达变化;细胞转染MiR-20a mimics,CKIP-1 siRNA,在荧光显微镜下观察转染效果,应用qRT-PCR测定过表达及干扰效率;qRT-PCR检测过表达MiR-20a及干扰CKIP-1对细胞成骨分化的影响及过表达MiR-20a对CKIP-1基因表达的影响。结果:成骨标记基因ALP、OSX、OCN、BSP随小鼠C3H/10T1/2细胞诱导过程逐渐升高,且成骨诱导分化过程中MiR-20a表达上调。过表达MiR-20a促进C3H/10T1/2细胞成骨分化,成骨标记基因碱性磷酸酶(ALP)、RUNX2、OSX、0CN、BSP显著高于对照组,并且抑制CKIP-1的表达;干扰CKIP-1能促进细胞成骨标记基因表达。结论:MiR-20a可能通过下调骨形成负调节因子CKIP-1的表达促进C3H/10T1/2细胞成骨分化。

丹皮酚激活CKIP-1对高糖诱导的肾小球系膜细胞纤维化的影响

目的观察丹皮酚通过激活CKIP-1,活化Nrf2抗氧化应激通路,进而抵抗高糖诱导的肾小球系膜细胞(glomerular mesangial cells,GMCs)中纤维连接蛋白(fibronectin,FN)和细胞间黏附分子1(intercellular cell adhension molecule-1,ICAM-1)表达增加的作用。方法采用高糖刺激的GMCs体外模型,观察丹皮酚对模型细胞FN、ICAM-1等炎性纤维化成分表达及CKIP-1、Nrf2抗氧化通路的影响;采用小分子RNA干扰GMCs CKIP-1的蛋白表达,免疫印迹法检测GMCs内Nrf2、HO-1、SOD1蛋白表达,DHE荧光探针技术检测细胞内超氧化物含量。结果在高糖诱导的GMCs,丹皮酚能上调CKIP-1蛋白的表达,增加Nrf2的水平,以及Nrf2信号通路下游靶因子HO-1、SOD1的表达,有效减少胞内超氧化物和H_2O_2含量,最终逆转FN、ICAM-1表达的增加。在干扰CKIP-1表达后,丹皮酚升高Nrf2及HO-1、SOD1的作用明显减弱,不能有效减少胞内活性氧水平,最终不能下调FN、ICAM-1的蛋白表达。结论激活CKIP-1,活化Nrf2信号通路,可能是丹皮酚抑制高糖引起的FN、ICAM-1上调的分子机制之一。

CKIP-1过表达对大鼠体外破骨细胞增殖影响的研究

目的分离培养大鼠破骨细胞,构建CKIP-1过表达慢病毒,观察被CKIP-1过表达慢病毒感染的体外大鼠破骨细胞的细胞增殖情况,探讨CKIP-1基因对体外大鼠破骨细胞增殖的影响。方法分离、培养SD大鼠原代破骨细胞,用抗酒石酸酸性磷酸酶染色法鉴定。构建CKIP-1过表达载体,完成慢病毒包装。将破骨细胞分为A组(破骨细胞空白对照组)、B组(破骨细胞+空载病毒组)、C组(破骨细胞+CKIP-1过表达病毒组),分别进行对应处理,qRT-PCR检测CKIP-1基因表达效果,CCK-8试剂盒检验破骨细胞的相对数量。结果成功鉴定大鼠原代破骨细胞分离培养。qRT-PCR检测破骨细胞中CKIP-1的mRNA水平结果显示:相比A组和C组,在感染CKIP-1病毒的C组,CKIP-1的基因水平有较高表达(P<0.01),CKIP-1过表达载体过表达效果明显,载体构建成功。CCK-8试剂盒检测各组细胞增殖的结果显示:相比A组和C组,感染CKIP-1病毒的C组的细胞增殖比例显著升高(P<0.01)。结论成功分离培养出大鼠破骨细胞。成功构建CKIP-1过表达慢病毒,并感染体外大鼠破骨细胞。CKIP-1的过表达具有促进体外大鼠破骨细胞增殖的功能。

极度低氧条件下Ckip-1 siRNA促进骨髓间充质干细胞成骨分化作用

目的探讨极度低氧条件下Ckip-1 siRNA促进骨髓间充质干细胞(BMSCs)成骨分化作用。方法差速贴壁法分离培养兔BMSCs,常氧(20%)及极度低氧(1%)条件下培养72 h,实时荧光定量PCR(qPCR)及Western blot检测成骨基因Run相关转录因子2(Runx2)、SMAD5及骨形态发生蛋白2(BMP2)表达,培养3、5、7 d后检测上清中碱性磷酸酶(ALP)活性。再将BMSCs置于1%氧浓度下培养72 h,观察Ckip-1 siRNA对Runx2、SMAD5及BMP2表达及ALP活性的影响。结果 1%氧浓度下BMSCs的成骨基因表达及ALP活性明显低于20%氧浓度下,差异有统计学意义(P <0.05);Ckip-1 siRNA转染后BMSCs成骨基因表达及ALP活性明显高于未转染,差异有统计学意义(P <0.05)。结论极度低氧可抑制BMSCs成骨分化能力,而Ckip-1 siRNA促进BMSCs在极度低氧条件下向成骨细胞分化。

CKIP-1对小鼠皮肤纤维化及TGF-β1和collagen-1表达的影响

目的:分析CKIP-1基因敲除后对皮肤纤维化的作用,并检测其对TGF-β1和collagen-1表达的影响。方法:取6月龄CKIP-1基因敲除小鼠作为实验组,与同窝雄性野生型小鼠进行对照,观察小鼠皮肤大体形态变化,再通过HE和masson染色分析皮肤的组织学改变,最后通过免疫组化检测皮肤纤维化相关的重要细胞因子TGF-β1和collagen-1的分子表达情况。结果:CKIP-1基因敲除小鼠皮肤较硬、弹性较差,镜下观察皮肤角化增加,表皮层和真皮层增厚,纤维扭曲、增粗,胶原含量显著增加,免疫组化检测发现TGF-β1和collagen-1分子表达增加,且TGF-β1在表皮及真皮交界处表达增加最为显著。结论:小鼠CKIP-1基因敲除后皮肤出现明显的纤维化改变,可能与TGF-β1表达增加相关。

Ckip-1对小鼠耳廓软骨发育的影响

目的:探讨酪蛋白激酶2相互作用蛋白1(Ckip-1)对小鼠颅颌面耳廓软骨发育的影响。方法:取6月龄Ckip-1基因敲除小鼠(Ckip-1-/-)作为实验组,野生型小鼠(WT)作为对照组(n=6、同窝、雄性)行动物表型观察及组织学切片分析,评估Ckip-1-/-小鼠耳廓大体及组织学变化。另通过siRNA干扰技术下调小鼠软骨细胞系ATDC5中Ckip-1表达,通过扫描电镜、MTT及QPCR等实验,观察细胞形态、增殖能力及软骨细胞分化相关基因表达的变化。结果:Ckip-1-/-小鼠呈小耳畸形,组织学切片可见软骨结构紊乱,幼稚软骨细胞增多。Ckip-1敲低组软骨细胞体现出伸展面积增加、增殖能力下降、软骨早期分化因子增加及晚期分化因子下调等趋势。结论:Ckip-1基因可能通过调控软骨细胞增殖及分化对小鼠耳廓发育产生影响。

miR-98-5调控CKIP-1促小鼠骨髓间充质干细胞成骨分化的实验研究

目的探讨microRNA(miRNA)对小鼠间充质干细胞的成骨分化的影响及其调控机制。观察生物体水平的miRNA调控CKIP-1基因表达、小鼠骨组织损伤的修复。方法(1)利用病毒转染技术降低CKIP-1基因的表达,获得低表达CKIP-1基因的小鼠间充质干细胞。低表达细胞与对照细胞利用miRNA基因芯片技术在成骨分化诱导过程中筛选出差异表达的miRNA。(2)高表达或低表达候选的miRNA,在成骨分化过程中检测CKIP-1基因的表达(mRNA,蛋白)和成骨标志基因mRNA(RUNX2、OCN、CO1I、BSP、OSX)。证实miRNA对CKIP-1的调控作用。(3)构建合适的动物体miRNA抑制剂,抑制候选miRNA的表达。观察CKIP-1基因的表达水平(mRNA,蛋白)、动物水平在成骨形成(整体骨量、骨缺损恢复)方面的差异,证实候选miRNA在动物水平上调控的有效性。结果筛选出miR-98-5,抑制其表达后CKIP-1基因mRNA和蛋白表达下降;成骨标志基因表达明显上升(RUNX2、OCN、CO1I、BSP、OSX);在动物水平上抑制miR-98-5的表达后小鼠整体骨量增加、骨缺损恢复加快,表型与CKIP-1敲除模型鼠相同。结论 miR-98-5p对间充质干细胞成骨分化和小鼠骨缺损恢复有促进作用。通过调控miRNA表达的方式或许可以用于治疗日常病理性骨质疏松和促进骨损伤恢复,为临床骨科相关疾病的治疗提供新的思路。

siRNA干扰技术对沉默CKIP-1基因大鼠进展性牙周炎影响的研究

目的:通过siRNA干扰技术沉默络蛋白激酶2-作用蛋白1(CKIP-1)基因,以观察其对大鼠牙周炎发生发展的影响。方法:取SPF级SD大鼠9只,并将其随机分为空白对照组(BC组)、阴性对照组(NC组)、阳性对照组(PC组)(n=3)。其中NC、PC两组均采用双侧上颌第二磨牙细线结扎和注射LPS-PG的方法建立牙周炎模型,并在造模期间对PC组注射CKIP-1 siRNA干扰;NC组注射生理盐水作为对照。造模加干预4周后,分别对所有大鼠的双侧上颌骨进行Micro-CT扫描,分析其骨缺损高度和根分叉处牙槽骨体积的变化;然后再取其双侧上颌骨标本并制作近远中向牙周牙体组织联合切片,常规HE染色观察其牙槽骨破坏及牙周组织炎症反应情况。结果:Micro-CT扫描显示:NC组的骨缺损程度大于PC组,其牙槽骨吸收高度(mm)分别为0.9606±0.1112、0.6759±0.0514,根分叉处牙槽骨体积(%)分别为0.5958±0.014、0.7509±0.0355(P<0.05)。组织学观察显示:相比于PC组,NC组大鼠的牙槽骨吸收更明显,且牙周膜纤维排序紊乱。结论:通过siRNA干扰技术沉默CKIP-1基因后,可减少大鼠牙周炎模型的骨缺损破坏程度及炎症反应。

CKIP-1对小鼠颞下颌关节软骨基质的影响

目的:探索酪蛋白激酶2相互作用蛋白-1(CKIP-1)在调控颞下颌关节软骨基质中的作用及机制。方法:比较同窝野生型及CKIP-1敲除纯合(CKIP-1^(-/-))小鼠颞下颌关节软骨细胞外基质变化,利用RNA干扰技术建立CKIP-1稳定低表达ATDC5细胞模型并检测细胞外基质分泌情况,通过转录组测序及生物信息学分析,筛选CKIP-1敲低后与软骨细胞调控相关的差异基因及关键信号通路,实时荧光定量PCR(qPCR)验证筛选结果。结果:与野生型相比,CKIP-1^(-/-)小鼠颞下颌关节软骨细胞外基质显著减少;敲低CKIP-1后ATDC5增殖、分化及软骨发育相关基因表达显著变化;验证结果表明CKIP-1敲低后可能通过Hedgehog等信号通路影响软骨细胞外基质的分泌。结论:CKIP-1参与调控关节软骨细胞外基质分泌,其调控作用主要是通过Hedgehog等通路实现的。

CKIP-1对不同时间和部位松质骨影响的Micro-CT分析

目的探讨酪蛋白激酶2相互作用蛋白1(CKIP-1)对不同时间股骨和下颌骨松质骨变化的影响。方法取3个月和6个月CKIP-1基因敲除小鼠(CKIP-1^(-/-))作为实验组,野生型小鼠(WT)作为对照组(n=5、同窝同性别、雄性),分别取股骨和下颌骨行Micro-CT扫描,对其股骨和下颌骨松质骨进行定量分析,评估CKIP-1在不同骨发育阶段对不同部位骨量变化的影响。结果在3个月时,实验组较对照组股骨和下颌骨的BV/TV分别增加2.54%和1.69%,在6个月时分别增加3.77%和2.82%(P<0.05)。从3~6个月时,股骨和下颌骨的BV/TV分别下降了4.42%和1.1%(P<0.05)。结论股骨较下颌骨对CKIP-1基因调控骨量更为敏感,随着时间变化也更加明显。

CKIP-1基因对骨质疏松影响机制的研究进展

骨质疏松症（0P）主要是因为骨重塑过程平衡被打破，骨形成与骨吸收过程中后者占主导地位，导致骨量减少、骨微结构破坏、骨折概率增大的一种严重危害患者生命健康的骨代谢疾病。大量研究表明，酪蛋白激酶2相互作用蛋白1（CKIP-1）在骨组织增殖、分化过程中起重要作用，其主要与Smad泛素调节因子1（Smurf1）相互作用进而影响骨代谢，从而改变骨质疏松的发生和发展。主要概述CKIP-1及其对骨组织成骨分化方向的影响及其机制，并对相关研究进行展望，为今后骨科相关疾病的临床治疗提供新的思路和方法。

益气温经方对CKIP-1介导的破骨细胞凋亡的影响

目的:观察益气温经方对酪蛋白激酶2相互作用蛋白1(Casein Kinase 2Interaction Protein 1,CKIP-1)介导的破骨细胞凋亡程度的影响。方法:从SD乳鼠中分离破骨细胞体外培养,建立CKIP-1过表达和低表达载体,病毒包装构建稳定表达的细胞系。分为以下5组:破骨细胞对照组(A组),破骨细胞+空载病毒组(B组),破骨细胞+CKIP-1过表达病毒组(C组),破骨细胞+CKIP-1过表达病毒+益气温经方处理组(D组),破骨细胞+CKIP-1低表达病毒组(E组)。病毒感染96h后,Annexin VFITC/PI检测细胞凋亡。结果:在破骨细胞中,与A组相比,过表达CKIP-1病毒组凋亡细胞比例显著降低,差异有统计学意义(P=0.017),而益气温经方处理后,凋亡细胞比例有升高的趋势,与A组相比差异无统计学意义(P=0.059),与C组相比差异有统计学意义(P=0.000 6);与A组相比,低表达CKIP-1组凋亡细胞比例显著升高,差异有统计学意义(P<0.000 1)。结论:CKIP-1具有抑制破骨细胞凋亡的功能,益气温经方可能通过逆转这种趋势,抑制骨吸收,从而起到治疗骨质疏松的作用。

慢病毒下调酪蛋白激酶2相互作用蛋白1表达的骨髓间充质干细胞修复骨质疏松大鼠牙槽骨缺损

背景:在口腔牙槽骨修复治疗过程中,患者的全身状况尤其是骨质疏松症等系统性疾病往往会影响治疗效果,近来发现酪蛋白激酶2相互作用蛋白1(casein kinase 2-interacting protein-1,CKIP-1)具有负调控成骨的作用,因此有希望作为新的靶点用于治疗骨质疏松。目的:探究CKIP-1表达下调的骨髓间充质干细胞对骨质疏松大鼠牙槽骨缺损的修复作用。方法:(1)从1周龄SD乳鼠股骨及胫骨骨髓中分离培养出骨髓间充质干细胞,慢病毒转染降低骨髓间充质干细胞中的CKIP-1水平;(2)通过维甲酸[70 mg/(kg·d)]灌胃21 d的方式建立骨质疏松SD大鼠模型,将CKIP-1表达下调的骨髓间充质干细胞与明胶海绵复合体、空载体转染的骨髓间充质干细胞与明胶海绵复合体、明胶海绵分别植入骨质疏松大鼠模型牙槽骨缺损内,正常组将明胶海绵植入正常大鼠牙槽骨缺损内。术后正常喂养30 d后,取上颌牙槽骨进行苏木精-伊红染色并通过Lane-Sandhu组织学评分和新生骨百分比评估骨缺损愈合情况,通过q RTPCR技术和免疫组化染色检测各组术区牙槽骨中CKIP-1、碱性磷酸酶、骨钙素的m RNA相对表达量及阳性表达情况。结果与结论:(1)与空载体转染相比,CKIP-1下调后的骨髓间充质干细胞中CKIP-1的m RNA相对表达量减少(P <0.05);(2)与植入空载体转染的骨髓间充质干细胞与明胶海绵复合体组、明胶海绵组相比,植入CKIP-1表达下调的骨髓间充质干细胞与明胶海绵复合体组Lane-Sandhu组织学评分和新生骨百分比显著升高(P <0.05),与正常组相近;碱性磷酸酶、骨钙素表达显著升高(P <0.05);(3)结果说明,局部移植CKIP-1下调的骨髓间充质干细胞对骨质疏松大鼠牙槽骨缺损具有明显的修复作用。

酪蛋白激酶2相互作用蛋白1调控骨质疏松大鼠骨髓间充质干细胞的成骨能力

背景:目前对酪蛋白激酶2相互作用蛋白1(casein kinase 2-interaction protein-1,CKIP-1)分子机制的体外研究主要集中在基因敲除小鼠来源成骨细胞或骨髓间充质干细胞,鲜见报道骨质疏松模型大鼠来源骨髓间充质干细胞中CKIP-1表达的研究。目的:探讨下调CKIP-1基因前后骨质疏松状态骨髓间充质干细胞成骨分化能力的变化。方法:用维甲酸诱导雌性SD大鼠骨质疏松模型,采用全骨髓贴壁法体外培养骨质疏松组、正常组大鼠骨髓间充质干细胞。成骨诱导后进行茜素红染色、碱性磷酸酶染色及实时定量RT-PCR检测骨桥蛋白、Runx2 mRNA的相对表达,实时定量RT-PCR检测成骨诱导过程中2组细胞中CKIP-1的动态表达;通过基因转染沉默CKIP-1基因,成骨诱导后进行茜素红染色、碱性磷酸酶染色及实时定量RT-PCR检测骨桥蛋白、Runx2 mRNA的相对表达。结果与结论:①与正常组相比,骨质疏松组骨髓间充质干细胞茜素红染色钙结节定量、碱性磷酸酶活性及骨桥蛋白、Runx2的mRNA水平降低(P<0.05),骨质疏松组骨髓间充质干细胞中CKIP-1基因动态表达水平总体偏高;②与未下调CKIP-1的骨质疏松组骨髓间充质干细胞相比,下调CKIP-1基因表达后,骨质疏松组骨髓间充质干细胞茜素红染色钙结节定量、碱性磷酸酶活性及骨桥蛋白、Runx2的mRNA水平明显升高(P<0.05);③结果表明,维甲酸诱导的骨质疏松大鼠骨髓间充质干细胞成骨能力降低,下调CKIP-1基因可以部分提高其成骨分化能力。

CKIP-1 limits foam cell formation and inhibits atherosclerosis by promoting degradation of Oct-1 by REGγ

With the support by the National Natural Science Foundation of China,the research team directed by Prof.Zhang LingQiang(张令强)at the State Key Laboratory of Proteomics,National Center of Protein Sciences(Beijing),Beijing Institute of Lifeomics,recently reported that CKIP-1 limits foam cell formation and inhibits atherosclerosis by promoting degradation of Oct-1 by REGγ.

肠型胃癌细胞中酪蛋白激酶2相互作用蛋白1与转化生长因子β_1表达的相关性

目的探讨酪蛋白激酶2相互作用蛋白1(CKIP-1)与转化生长因子β1(TGF-β1)在肠型胃癌细胞中表达的相关性。方法 Western blotting方法检测不同分化肠型胃癌细胞(高分化MKN28细胞、中分化SGC7901细胞和低分化BGC823、MKN45及AGS细胞)中CKIP-1与TGF-β1表达,Spearman相关性分析CKIP-1与TGF-β1表达相关性;分别构建过表达及干扰表达CKIP-1的人肠型腺癌MKN28细胞模型,Westernblotting方法检测各组细胞TGF-β1表达。结果与高分化胃癌MKN28细胞相比,中分化SGC7901细胞与低分化BGC823、MKN45及AGS细胞CKIP-1表达均降低、TGF-β1表达均升高(P <0.01);与中分化SGC7901细胞相比,低分化BGC823、MKN45及AGS细胞CKIP-1表达降低、TGF-β1表达升高(P <0.01);Spearman相关性分析显示不同分化肠型胃癌细胞中CKIP-1与TGF-β1表达负相关(r=-0.689 2,P <0.01)。与空白对照组相比,CKIP-1过表达组MKN28细胞TGF-β1表达下降(P <0.01),CKIP-1干扰表达组MKN28细胞TGF-β1表达增加(P <0.01)。结论肠型胃癌细胞中CKIP-1与TGF-β1蛋白表达负相关,CKIP-1蛋白可能通过负性上调TGF-β1表达后促进了肠型胃癌的恶性转化、发展及浸润转移。