ClC-3氯离子通道对高分化鼻咽癌细胞突起形成的影响

目的:探讨ClC-3氯离子通道在高分化鼻咽癌CNE-1细胞突起形成中的作用。方法:采用免疫荧光技术(Alexa Fluor 488标记抗体)检测CNE-1细胞中ClC-3蛋白的分布;MQAE荧光探针检测细胞内氯离子浓度;吸附式单通道膜片钳技术记录氯离子单通道活动;采用FAM标记的siRNA转染细胞,实验分为对照组、阴性对照(NC) siRNA组和ClC-3 siRNA组;激光共聚焦显微镜观察转染后绿色荧光情况,流式细胞术检测转染效率,Western blot法测ClC-3蛋白的表达,倒置显微镜下观察CNE-1细胞突起形成情况。结果:ClC-3蛋白主要分布于细胞膜和细胞质,且在细胞膜突起形成部位明显聚集;细胞突起处MQAE荧光弱,氯离子浓度较高,而突起根部荧光强,氯离子浓度较低;突起根部记录到翻转电位为4.06 mV的单通道电流,在-120 mV钳制电压下,该通道电导约为78.4pS;siRNA转染细胞48 h后,ClC-3 siRNA组细胞ClC-3蛋白表达量显著降低(P<0.01),且ClC-3 siRNA组细胞无片状伪足伸出,而对照组和NC siRNA组细胞伸出明显的片状伪足;此外,3组细胞均有数量不等的丝状伪足形成。结论:ClC-3影响CNE-1细胞贴壁生长时胞膜伸出突起、形成片状伪足的过程。

人源CLC-7/Ostm1复合物结构揭示一种新构象

CLC-7是位于溶酶体膜上的Cl^(-)/H^(+)交换转运蛋白。CLC-7及其β亚基Ostm1的缺陷均会导致骨硬化症和神经退行性疾病。本文解析了一个具有3.6Å分辨率的人源CLC-7/Ostm1复合物的冷冻电镜结构。该结构揭示了CLC-7/Ostm1异源四聚体的一种新构象,其中CLC-7的胞质结构域可能由于高度柔性而缺失。柔性的细胞质结构域无法限制CLC-7的跨膜结构域,从而允许两个亚基相对远离,使得CLC-7跨膜结构域的二聚界面与已知具有稳定胞质结构域的结构相比减小了约一半。这种二聚界面的变化影响了多个骨硬化症相关残基的相互作用。

不同径高比柱状载氧体固定床CLC非均相反应及共轭传递过程的数值分析

为了解柱状载氧体的外形如何影响组分扩散与复杂间隙流动,并最终影响整体气固非均相反应性能,采用计算流体力学(CFD)方法对不同径高比的柱状载氧体的固定床化学链燃烧(CLC)过程进行了数值分析。结果表明:柱状载氧体颗粒的径高比越大,填充床反应器中气流平均速度和床层压降越大;相比于常规的圆柱载氧体颗粒,薄片状或棒状颗粒具有更大的比表面积和更短的组分扩散距离,能够缓解多孔颗粒载氧体中的内扩散限制,从而提高整体气固非均相反应速率和载氧体转化率;在相同径高比下,薄片状颗粒填充床具有更大的内扩散传质速率和对流传质速率,综合共轭传质能力更强。

CLC谐振型感应电能传输系统的H_∞控制

CLC谐振型感应电能传输系统较传统的LC谐振型系统具有更大的谐振容量和更小的频率漂移,但由于系统的高阶及多周期点特性,对CLC型系统的控制更为困难。为实现CLC谐振型系统的输出鲁棒控制,将系统状态变量及非线性开关函数进行频域线性化,通过平衡点变换,得到平衡点附近的广义状态空间平均(generalized state space averaging,GSSA)扰动模型。建立了系统的H∞控制系统结构,提出GSSA模型误差扰动有界定理并给出了证明。给出了相应的H∞扰动控制律,并通过仿真及实验结果验证了该模型及控制方法的有效性。

小功率开关电源CLC纹波抑制电路特性分析

在便携式仪器中通常使用小功率开关电源为系统供电,电源的纹波噪声直接影响系统的性能。采用MAX606芯片设计了12 V的开关电源,以π型CLC低通滤波器对其输出纹波进行抑制,通过改变电解电容的类型(贴片铝电解、直插铝电解、贴片钽电解)、电容值大小、电感值大小以及负载,分析了CLC电路纹波抑制特性。结果表明,小功率开关电源CLC滤波电路中,电感对纹波抑制作用较大,电容作用较小;贴片铝电解效果最好,钽电解次之,直插铝电解效果最差;应选用mH级电感和100μF以上电容。

基于盐逆境下植物CLC同源基因的发掘和功能解析的研究进展

植物盐害的阴离子毒害主要由Cl^-造成,盐逆境下植物体内Cl^-吸收、运输及其调控的分子机制已成为植物耐盐性研究不可忽视的重要方面,但有关Cl^-毒害问题相对Na^+毒害和适应的研究在过去较少受到关注。Cl^-通道(chloride channels,CLCs)是一类广泛分布于原核和真核生物细胞膜(主要是内膜系统),以介导Cl^-为代表的阴离子运输的重要转运蛋白家族。本文对目前已报道的包括拟南芥、大豆、水稻等多种植物的CLC同源基因及其编码蛋白进行了系统的生物信息学分析,并对植物CLC同源基因参与耐氯(盐)功能解析方面的研究进展进行了归纳,为今后进一步发掘和利用植物耐氯(盐)基因,全面揭示植物耐盐性的分子机制和最终寻求提高大豆、水稻等作物耐氯(盐)性的分子育种途径,指明可借鉴的研究方向。

ClC-3反义寡核苷酸对ConA诱导的T淋巴细胞增殖的影响

目的 研究ClC 3蛋白在T淋巴细胞增殖过程中的作用。方法 采用脂质体转染技术 ,将寡核苷酸导入细胞 ,免疫印迹 (WesternBlot)方法分析ClC 3蛋白表达 ;[3H] TdR参入法观察ClC 3反义寡核苷酸对细胞增殖的作用。结果 ①ClC 3反义寡核苷酸浓度依赖性地抑制ConA诱导的ClC 3蛋白的表达 ;②ClC 3反义寡核苷酸浓度依赖性地抑制ConA诱导的T淋巴细胞增殖。结论 ClC

大豆基因组CLC同源基因家族的生物信息学分析

利用NCBI网站、Phytozome数据库和有关生物信息学软件,对大豆基因组CLC（chloride channel）同源基因家族进行系统的预测分析和比较。结果表明：大豆CLC同源基因有8～9个拷贝,分别分布于第1、5、9、11、13、16和19号染色体上,内含子数目为4～23;编码的大豆CLC蛋白氨基酸数量为725～823,整体一致性为63.43%,相对分子质量为（80～91）×103,理论等电点为6.45～8.94,带正或负电荷氨基酸残基比例为7%～10%,均为跨膜蛋白（含9～12个跨膜区）,除Glyma16g06190外均含有2个CBS结构域;具有（Ⅰ）GS/PGIPE、（Ⅱ）GKE/AGPLVH和（Ⅲ）PVGGVLFALEE/G 3个氨基酸残基保守区,其中相应关键氨基酸残基位点决定了它们不同的阴离子（Cl-或NO-3）优先选择属性和蛋白功能（通道或转运蛋白）属性。它们都与拟南芥CLC蛋白亚家族Ⅰ关系较近,其中GmCLC1（Glyma05g14760）、GmsCLC1、Glyma16g06190和Glyma19g25680与AtCLCa、AtCLCb处于同一分支,整体显示序列一致性为87.79%;Glyma09g28620和Glyma16g33351与AtCLCc、NtCLC1同源关系较近,序列一致性为70.99%;Glyma13g23080则与AtCLCg在同一分支,序列一致性为74.21%;而Glyma01g44950和Glyma11g00690则与AtCLCd同源关系最近,序列一致性为90.68%。qRT-PCR分析结果显示,在150mmol·L-1NaCl处理24 h过程中,GmsCLC1基因在栽培大豆N23674品种、野生大豆BB52种群及其后代4076株系中均上调表达,其中在BB52根中上升最显著。结论：大豆多个CLC同源基因在进化过程中发生的功能分化,可能在正常或盐胁迫条件下植株体内阴离子（包括Cl-、NO-3）稳态重建方面发挥不同作用。

膀胱移行细胞癌的ClC-3和NF-κB的表达及意义

目的:探讨ClC-3和NF-κB在膀胱移行细胞癌中的表达及意义。方法:应用免疫组织化学染色技术检测31例病理诊断为膀胱移行细胞癌和6例正常膀胱组织中ClC-3和NF-κB的表达。结果:膀胱移行细胞癌组织中ClC-3主要在癌细胞的胞膜表达,阳性表达率74%(23/31)。其中膀胱移行细胞癌Ⅰ级阳性表达率40%(4/10),Ⅱ级阳性表达率81%(9/11)、Ⅲ级阳性表达率100%(10/10)。NF-κB在癌细胞的胞浆内表达,阳性表达率83%(26/31)。其中膀胱移行细胞癌Ⅰ级阳性表达率60%(6/10),Ⅱ级阳性表达率90%(10/11),Ⅲ级阳性表达率100%(10/10)。6例正常膀胱组织中仅有1例ClC-3表达弱阳性,NF-κB表达均为阴性。膀胱移行细胞癌组织中ClC-3和NF-κB阳性表达率高于正常膀胱组织(P<0.01)。结论:ClC-3和NF-κB可能与膀胱移行细胞癌病理分级和增殖有关。

氯离子通道CLC-3在乳腺癌中的表达及临床意义

目的研究氯离子通道CLC-3在乳腺癌组织中的表达,探讨其在乳腺癌诊断方面的临床意义及为乳腺癌发生发展方面进一步研究提供基础。方法在27例行乳腺癌改良根治术的乳腺癌患者中,分别将乳腺癌癌灶和周围正常组织用抗CLC-3抗体进行免疫组织化学染色。结果CLC-3蛋白主要表达在瘤细胞的胞浆和/或胞膜上。由于没有组间差异,应用χ2检验进行组间比较,其中乳腺癌患者21例(77.77%)阳性,6例(22.33%)阴性;乳腺正常组织中3例(11.1%%)阳性,24例(88.9%)阴性。χ2为24.3,P小于0.05,说明良恶性之间有明显差异。结论氯离子通道CLC-3在乳腺癌组织中高表达,恶性之间有明显差异。提示氯离子通道在乳腺癌发生及发展过程中有着病理生理及病理方面的临床意义,为乳腺癌的诊断及进一步研究提供临床应用基础。

刀豆蛋白A促进T淋巴细胞增殖与ClC-3蛋白的关系

目的 研究刀豆蛋白A(ConA)促进T淋巴细胞增殖与内源性ClC 3蛋白的关系。方法 免疫印迹 (Westernblot)法检测ClC 3蛋白表达 ;[3 H] TdR参入法观察ConA对细胞增殖的影响。结果 ①T淋巴细胞上有内源性ClC 3蛋白表达 ,分子量约为 80ku ;②ConA可浓度依赖性地促进T淋巴细胞增殖 ;③ConA刺激T淋巴细胞 2 4、4 8、72h后 ,ClC 3蛋白表达均增加 ;刺激 4 8h后ClC 3蛋白表达增加最多。④ConA可浓度依赖性地增加ClC 3蛋白表达。结论 T淋巴细胞上存在内源性ClC 3蛋白表达 ;ClC

人ClC-2基因小分子干扰RNA真核表达载体的构建和鉴定

目的:构建靶向人C lC-2基因小分子干扰RNA(siRNA)真核细胞表达载体。方法:根据DEQOR提供的siRNA设计原则和程序,设计两个靶向C lC-2基因的发夹状siRNA;通过化学合成的方法合成两对分别互补的寡核苷酸链,退火后得到编码该siRNA的C lC-2基因片段。将该片段连接至经BglⅡ和HindⅢ双酶切的真核细胞表达载体pSUPER.puro的多克隆位点,转化扩增提取质粒;对重组质粒进行EcoRⅠ和HindⅢ双酶切电泳鉴定和DNA序列分析鉴定。脂质体L ipofectam ineTM2000介导瞬时转染,通过RT-PCR检测人胶质瘤细胞系BT-325细胞中C lC-2mRNA表达。结果:经酶切电泳鉴定和DNA序列分析鉴定,目的片段与真核细胞表达载体pSUPER.puro连接正确。转染两重组质粒细胞的C lC-2 mRNA表达明显降低。结论:成功构建人C lC-2基因干扰真核表达载体2个,分别命名为pSUPER.puro-siC lC-21和pSUPER.puro-siC lC-22,可用于进一步研究C lC-2基因对人胶质瘤侵袭和迁移活动的影响。

氯通道ClC-2反义寡核苷酸对顺铂作用下神经胶质瘤U251细胞侵袭力的影响

目的:探讨氯通道ClC-2反义寡核苷酸(AON)抑制ClC-2基因表达对顺铂(DDP)作用下神经胶质瘤U251细胞侵袭力的影响,为ClC-2成为神经胶质瘤综合治疗的新基因靶点提供理论依据。方法:U251细胞按处理方法不同分为对照组(转染无义寡核苷酸)、AON组(转染ClC-2反义寡核苷酸)、DDP组(无义寡核苷酸与顺铂联用)和AON+DDP组(ClC-2反义寡核苷酸与顺铂联用)。应用RT-PCR检测相关基因ClC-2、cyclin D1、MMP-2、MMP-9 mRNA表达;Transwell小室侵袭实验检测各组细胞侵袭力;Transwell小室迁移实验检测各组细胞迁移率。结果:与对照组比较,AON组、DDP组和AON+DDP组ClC-2、cyclin D1、MMP-2、MMP-9 mRNA表达率降低(P<0.05);Transwell小室侵袭实验中对照组、AON组、DDP组和AON+DDP组侵袭细胞数分别为81.00±4.58、42.01±4.36、48.33±2.52和12.67±5.13;与对照组比较,AON组、DDP组和AON+DDP组穿透细胞数明显降低(P<0.05)。Transwell小室迁移实验中AON组、DDP组、AON+DDP组细胞迁移率(%)分别为72.40±2.20、51.48±1.29、37.87±1.50,与对照组比较均明显降低(P<0.05)。结论:①转染ClC-2反义寡核苷酸能有效抑制ClC-2 mRNA表达;②抑制ClC-2 mRNA能降低U251细胞的迁移力和侵袭力;③ClC-2 mRNA表达降低可促进顺铂对U251细胞迁移力和侵袭力的抑制作用。

ClC-3 siRNA抑制鼻咽癌细胞调节性容积回缩

目的用siRNA沉默ClC-3氯通道,探讨ClC-3氯通道在鼻咽癌CNE-2Z细胞调节性容积回缩(regulatory volumedecrease,RVD)中的作用。方法使用终浓度100 nmol/L的ClC-3 siRNA转染鼻咽癌CNE-2Z细胞,流式细胞术检测siRNA的转染率,Western blotting检测ClC-3蛋白表达,活细胞图像系统分析对照组和ClC-3 siRNA组细胞在低渗(160mOsm/L)刺激时的容积调节能力。结果 ClC-3 siRNA转染率为(63.8±3.8)%(n=3,P<0.01),与对照组相比,ClC-3氯通道蛋白的表达减少(60.9±4.0)%(n=3,P<0.01)。对照组细胞的RVD为(42.6±2.8)%(n=20),ClC-3 siRNA组细胞在低渗液中的最大容积与对照组没有显著性差异,但RVD仅为(10.5±4.8)%,RVD抑制率达75.4%(P<0.01)。结论 ClC-3 siRNA成功转染鼻咽癌CNE-2Z细胞,特异性抑制ClC-3蛋白表达,显著降低细胞RVD能力,提示ClC-3氯通道在鼻咽癌细胞调节性容积回缩中起重要作用。

一种改进型CLC电流型谐振逆变器

针对电流型谐振逆变器中串联二极管反向过电压和负载槽路参数如何合理匹配的问题,提出了一种改进型CLC电流型谐振逆变器拓扑、通过串联缓冲电感、并联栅漏极电容,功率器件实现零电流开通、零电压关断,抑制了二极管产生浪涌电流;通过开关频率的改变以及三阶CLC负载中电容比例的定量分析,权衡输出电流与负载线圈支路电流大小,确定小容性的工作范围和输出有功功率最大值。试验结果证明所建拓扑的正确性、定量分析的有效性。

硼替佐米对多发性骨髓瘤CLC-3表达的影响

目的:研究接受硼替佐米化疗的多发性骨髓瘤(MM)患者在化疗前后CLC-3蛋白表达的变化,探讨硼替佐米对MM患者CLC-3的影响及疗效的变化。方法:流式细胞技术分离12例初发、及复发难治的多发性骨髓瘤患者的浆(瘤)细胞,检测其CLC-3蛋白表达情况。然后所有观察病例均予以硼替佐米为主的化疗方案治疗至少4(4-6)个疗程,检测其CLC-3蛋白表达的水平,了解该指标与临床疗效的关系。结果:12例MM患者治疗前的CLC-3均存在高表达。经硼替佐米为主的化疗方案治疗后,其表达水平呈下降趋势。6例完全缓解(CR)及4例非常好的部分缓解(VGPR)的患者,CLC-3表达水平恢复接近正常。结论:硼替佐米可以对多发性骨髓瘤患者的CLC-3的表达情况产生影响,CLC-3表达水平与硼替佐米疗效呈负相关性。硼替佐米直接能否下调CLC-3水平,以及氯通道可否作为治疗该病的新靶点值得进一步研究。

沉默ClC-3氯通道基因对HeLa细胞周期分布的影响

目的:探讨沉默HeLa细胞的ClC-3氯通道基因后细胞周期分布的变化及其作用机制。方法:依照siRNA设计原则构建沉默ClC-3基因的ClC-3 siRNA并转染HeLa细胞;实验分为空白对照组(control组)、转染试剂对照组(Lipo组)、阴性对照组(negative siRNA组)和ClC-3 siRNA组。采用real-time PCR检测ClC-3 siRNA的沉默效率;流式细胞术检测细胞周期分布情况;Western blot检测ClC-3蛋白及相关细胞周期蛋白(cyclin)D1、细胞周期蛋白依赖激酶(cyclin-dependent kinase,CDK)4、CDK6、P21和P27等表达。结果:CIC-3 siRNA成功沉默HeLa细胞的ClC-3基因。和其它组相比,ClC-3 siRNA组的细胞周期被阻抑在G_0/G_1期。CIC-3 siRNA组的cyclin D1、CDK4和CDK6蛋白表达水平明显下降,P21和P27蛋白表达水平明显上升。结论:沉默HeLa细胞ClC-3氯通道基因可影响cyclin D1、CDK4、CDK6、P21和27蛋白的表达水平胆抑HeLa细胞周期停滞在G_0/G_1期。

干扰ClC-2基因表达对胶质瘤BT-325细胞生长的影响

目的观察抑制容积调控氯通道ClC-2基因的表达对胶质瘤BT-325细胞生长的影响。方法设计和构建两个针对ClC2基因的小干扰RNA(siRNA)重组表达载体,用脂质体LipofectamineTM2000介导转染,将空载体质粒和两个重组质粒分别转染入BT-325细胞(依次为对照组、PP1组和PP2组);通过RTPCR检测ClC2基因mRNA表达变化;MTT分析检测细胞活性;流式细胞仪检测细胞周期。结果与对照组相比较,干扰组ClC2基因的mRNA水平明显降低,细胞生长速度明显减慢,细胞周期进程被阻滞在G1期。结论干扰胶质瘤细胞系BT-325细胞的ClC-2基因表达可以抑制细胞的生长,提示ClC2基因可能成为控制胶质瘤恶性生长的新靶点。

阻断CLC-3氯通道对结直肠癌细胞株生存率和侵袭转移能力的影响及其分子机制

目的:通过研究CLC-3在结直肠组织中的表达,探讨CLC-3对结直肠癌细胞株SW480、SW620的细胞生存率、侵袭转移能力的影响及其潜在的机制。方法:采用RT-PCR方法测定不同分期结直肠癌组织和正常结直肠组织中CLC-3的mRNA表达水平。运用CLC-3阻断剂DIDS、NPPB阻断SW480、SW620细胞的CLC-3表达后,采用CCK-8法实验检测细胞生存率,细胞侵袭实验检测细胞侵袭转移情况;并采用免疫印迹法测定阻断CLC-3表达后SW480、SW620细胞Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白表达。结果:结直肠癌组织中CLC-3 mRNA表达水平高于结直肠炎黏膜组织和正常结直肠组织(P<0.05),且CLC-3 mRNA表达和结直肠分期相关。抑制CLC-3表达后,SW480、SW620细胞的生存率和侵袭转移能力降低(P<0.05),且β-catenin、C-myc、cyclin D1、Ki-67、survivin表达降低(P<0.05)。结论:CLC-3高表达与结直肠的发生发展有潜在联系,其机制可能与Wnt/β-catenin有关,为CLC-3作为治疗结直肠癌的潜在新靶点提供实验基础。

沉默ClC-3氯通道基因对PC-12细胞凋亡的影响

目的:观察氯离子通道蛋白3(ClC-3)基因沉默对大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞PC-12凋亡的影响。方法:取处于对数生长期的PC-12细胞,随机分为4组:对照组(用正常培养基培养)、H_2O_2组(用300nmol/LH_2O_2诱导12h)、H_2O_2+空质粒组(细胞转染pGPU6/GFP24h后用H_2O_2诱导12h)、H_2O_2+siRNA组(细胞转染pGPU6/GFP-ClC-3-siRNA24h后用H_2O_2诱导12h)。通过CCK-8检测细胞存活率,流式细胞术检测细胞凋亡率,Westernblot法检测Caspase-3以及ClC-3蛋白的表达,实时荧光定量PCR检测ClC-3mRNA的表达。结果:与对照组比较,H_2O_2组、H_2O_2+空质粒组和H_2O_2+siRNA组均表现为细胞存活率下降,细胞凋亡增加,ClC-3mRNA和Caspase-3、ClC-3蛋白表达增加(P<0.05);H_2O_2组和H_2O_2+空质粒组比较,各指标差异无统计学意义(P>0.05);但与H_2O_2组、H_2O_2+空质粒组比较,H_2O_2+siRNA组细胞存活率较高,细胞凋亡率较低,ClC-3mRNA和Caspase-3、ClC-3蛋白表达较弱(P<0.05)。结论:ClC-3氯离子通道参与了H_2O_2诱导的PC-12细胞凋亡。