EGFP和CM-Dil示踪骨髓间充质干细胞构建组织工程骨的体内研究

目的:应用增强型绿色荧光蛋白(Enhanced green fluorescent protein,EGFP)和CM-Dil标记技术,观察组织工程骨在体内形成过程中种子细胞的变化和转归。方法:分别用EGFP慢病毒表达和CM-Dil染料的方法标记比格犬骨髓间充质干细胞(Bone mesenchymal stemcells,BMSCs),MTT法检测标记细胞的体外增殖能力。BMSCs接种珊瑚支架体外成骨诱导7天后,将未标记组、EGFP组和CM-Dil组分别植入裸鼠背部皮下,空白支架作为阴性对照。术后4、8、12周取材,HE染色观察成骨情况,EGFP组采用GFP免疫组化、CM-Dil组冰冻切片荧光显微镜下示踪BMSCs在体内的变化。结果:两种标记技术能高效标记BMSCs,标记前后细胞的体外增殖无显著性差异(P>0.05)。细胞-支架复合物植入体内12周后有新生骨形成,标记细胞数量随时间延长而逐渐减少,12周后仍显示有部分标记细胞存活。结论:EGFP和CM-Di l可用于示踪组织工程种子细胞,通过示踪说明BMSCs在体内组织工程骨成骨过程中发挥了重要作用。

CM-Dil与DAPI联合标记人羊膜上皮细胞的可行性研究

目的建立人羊膜上皮细胞（human amniotic epithelial cell，HAEC）的体外培养方法，并探讨氯甲基苯甲酰胺（CM—Dil）与4’，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）对HAEC进行联合标记示踪的可行性。方法运用酶消化法获取HAEC，收集第2代细胞，流式细胞仪检测CD29、CD34、CD44、CIM5和CD105的表达率，SP免疫化学法鉴定HAEC。CM—Dil与DAPI对HAEC进行体外标记，荧光倒置显微镜下观察1d、7d和14d的标记情况，台盼蓝染色检测细胞活力，CCK-8法检测细胞增殖以明确联合标记对体外培养HAEC生长特性的影响。结果HAEC贴壁培养后呈扁平多角形，CD29、CD34、CD44、CD45和CD105的阳性率分别为99．64％、2．21％、32．41％、0．84％、36．70％，细胞角蛋白Keratin阳性表达。HAEC在cM—Dil和DAPI联合标记1d后，荧光显微镜下可观察到细胞膜和细胞核分别在不同波长下呈红色和蓝色荧光，标记率为100％；14d后，经传代培养的HAEC荧光强度与1d时相近，细胞形态无改变。台盼蓝染色显示标记细胞存活率为96．8％-98．9％，CCK-8检测标记细胞的增殖力较未标记组差异无统计学意义（P〉0．05）。结论CM—Dil和DAPI可有效标记HAEC，染色简单、无细胞毒性，荧光衰减较慢，可作为HAEC的标记及示踪方法。

荧光活性染料(CM-Dil)对人骨髓间充质干细胞增殖能力的影响

目的:体外分离、培养人骨髓间充质干细胞(human bone marrow derived mesenchymal stem cells,hBMSCs),探讨应用不同浓度氯甲基苯甲酰氨荧光染料(CM-Dil)对hBMSCs增殖力的影响。方法:采用Ficoll梯密度离心法分离、培养hBMSCs,并促进其分别向成骨细胞、脂肪细胞分化;应用不同浓度CM-Dil分别标记第3代hBMSCs,观察不同浓度标记下细胞的荧光强度、标记效率、活性和增殖能力。结果:采用Ficoll梯密度离心法获得的hBMSCs,成骨、成脂分化染色阳性。不同浓度CM-Dil(5、10、20、30μmol/L)在30 min内均可成功标记hBMSCs,24 h后观察标记效率均达到98%以上(P>0.05)。直到20μmol/L的标记浓度对细胞的活力、增殖能力仍没有影响(P>0.05)。结论:CM-Dil是一种简便、安全的标记骨髓间充质干细胞的方法。

人脐带间质干细胞的CM-Dil标记及其移植在急性肾损伤大鼠体内的示踪研究

目的:探讨人脐带间质干细胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells,hucMSCs)用CM-Dil染料标记之后生物学特性及体内定位示踪情况。方法:采用脐带组织块贴壁培养法分离人脐带间质干细胞,用CM-Dil染料标记第3代hucMSCs;采用细胞计数法分析CM-Dil标记后hucMSCs的生长变化情况;通过活体成像仪观察CM-Dil染料标记的hucMSCs移植于急性肾损伤大鼠后的体内定位。结果:CM-Dil染料标记hucMSCs的效率很高;标记后的hucMSCs生长增殖能力没有发生明显变化;体内示踪可以观察到标记的hucMSCs。结论:CM-Dil标记不影响hucM-SCs的生长增殖特征,并且能够在体内示踪,为后续研究提供了实验基础。

CM-Dil标记人牙龈间充质干细胞在大鼠颅骨缺损修复模型中的示踪研究

目的:探讨氯甲基苯甲酰氨(CM-Dil)荧光染料体外标记人牙龈间充质干细胞(hGMSCs)对其增殖、分化能力的影响以及在体内荧光标记持续时间。方法:组织块法原代培养hGMSCs,采用流式细胞术检测间充质干细胞表面标志物,然后以CM-Dil标记hGMSCs,CCK-8检测标记后细胞的增殖;标记及未标记的细胞进行成骨及成脂诱导培养21 d后,分别进行茜素红染色和油红O染色。大鼠颅骨缺损实验检测CM-Dil标记的hGMSCs体内标记效果。结果:原代培养的hGMSCs高表达CD105、CD90和CD73,而阴性表达CD14、CD34、CD19、CD45和人类白细胞DR抗原(HLA-DR),符合间充质干细胞表面特征。与对照组相比,CM-Dil并不影响hGMSCs的增殖和成骨、成脂分化能力(P>0.05)。体内移植的CM-Dil标记hGMSCs在第8周时仍可检测到红色荧光。结论:CM-Dil在体外标记hGMSCs不会影响hGMSCs的干细胞特性,且体内标记时间长达8周,可作为干细胞体内标记示踪的方法之一。

CM-Dil体外标记脂肪基质干细胞及其在脂肪移植裸鼠模型体内示踪研究

目的探讨CM-Dil对脂肪基质干细胞(ADSCs)的体外标记及其在脂肪移植裸鼠模型的体内示踪。方法采用贴壁培养法分离、纯化、扩增ADSCs。取第3代细胞进行CD29、CD31免疫组化染色,用流式细胞仪检测细胞阳性率;对第3代细胞进行成骨、成脂诱导,鉴定其成骨成脂多向分化潜能。CM-Dil体外标记ADSCs,并用荧光显微镜检测。6周龄雌性BALB/c裸鼠制备脂肪移植裸鼠模型,将标记CM-Dil的ADSCs脂肪移植复合体移植入裸鼠背部皮下,移植后4周取脂肪移植物制备冰冻切片,荧光显微镜观察ADSCs的分布情况。结果脂肪组织中分离培养的ADSCs呈梭形生长,CD29表达阳性细胞比例为84.52%±4.91%,CD31表达阳性细胞比例为2.13%±0.95%,ADSCs能够分化为成脂细胞和成骨细胞。荧光显微镜显示,CM-Dil标记的ADSCs在裸鼠脂肪移植中表达阳性。结论CM-Dil能够体外标记ADSCs,可用于ADSCs在脂肪移植裸鼠模型的体内示踪,ADSCs可能参与了脂肪移植后的组织重建。

体外CM-DIL标记骨髓源性内皮祖细胞在胶原海绵上的研究

目的观察CM-DIL体外标记兔骨髓来源的内皮祖细胞(EPCs)的可行性及其在胶原海绵上的生长情况。方法用Percoll分离液的方法分离、培养EPCs,并进行鉴定;观察CM-DIL标记后的EPCs与胶原海绵的生物相容性,HE染色评价EPCs的生长情况。结果CM-DIL标记EPCs的细胞膜为红色,分离培养的EPCs其表面标志物CD31和CD34表达均为阳性,种植于胶原海绵上的EPCs可存活,并沿胶原海绵支架生长。结论CM-DIL可作为体外标记EPCs的方法,胶原海绵可作为一种较为理想的组织工程学支架材料。

CM-Dil标记示踪间充质干细胞可行性的体外试验

目的探讨氯苯甲酰氨-1,1′双十八烷基-3,3′,3′,3′-四甲基吲哚羰基花青高氯酸盐(CM-Dil)体外标记骨髓间充质干细胞的可行性。方法分离培养并鉴定大鼠骨髓间充质干细胞,分别用1、2、4μg/mL的CM-Dil标记间充质干细胞,观察标记后15min、24h、48h、72h、传5代、传8代的标记率;用流式细胞仪检测标记前后细胞周期的变化;用细胞计数Kit-8(CCK8)法检测细胞增殖能力。结果采用全骨髓贴壁法分离培养大鼠骨髓间充质干细胞CD44、CD29表达阳性,CD34、CD45表达阴性。1、2、4μg/mL CM-Dil标记15min后标记率分别为(31.60±1.25)%、(88.73±1.79)%、(96.89±1.31)%,差异有统计学意义(F=1 757.21,P=0.000);4组间生长曲线趋势大致相同,且4组间G1期、S期及G2/M期细胞百分比差异无统计学意义(P>0.05)。结论 4μg/mL CM-Dil细胞标记率高,无细胞毒性,可作为一种高效而稳定的体外标记间充质干细胞的方法。

CM-Dil标记肝纤维化大鼠骨髓源性内皮祖细胞实验研究

目的探讨建立CM-Dil荧光标记的肝纤维化大鼠骨髓源性内皮祖细胞的方法。方法 Wistar大鼠16只,四氯化碳皮下注射建立肝纤维化大鼠模型,分离培养肝纤维化大鼠骨髓源性内皮祖细胞,分为实验组和对照组,实验组采用CM-Dil荧光进行标记内皮组细胞,对照组未进行标记。采用激光共聚焦显微镜、流式细胞分析仪检测CM-Dil荧光标记率,观察2组细胞生长状态和细胞动力学。结果实验组CM-Dil标记的细胞呈红色荧光,标记阳性率为96.95%;实验组细胞生长状态良好,与对照组比较,生长曲线无明显改变。结论 CM-Dil可在体外成功标记肝纤维化大鼠骨髓源性内皮祖细胞。

RhoA基因沉默联合脐带间充质干细胞移植脑损伤大鼠功能的恢复

背景:研究认为Rho激酶可致使神经生长锥塌陷,对神经修复具有抑制作用。目的:脐带间充质干细胞移植同时联合RNAi介导的RhoA基因沉默,观察两者对脑损伤大鼠恢复的影响。方法:健康Wistar大鼠84只,采用液压颅脑损伤仪,给予253.3125-303.975kPa液压冲击力,制成重型液压颅脑损伤模型,随机分成为对照组,脐带间充质干细胞移植组,联合组(脐带间充质干细胞移植联合RhoA基因沉默)。CM-Dil标记的脐带间充质干细胞移植后采用改良神经功能损伤评分系统(mNSS)评价大鼠神经功能恢复情况,在创伤性脑损伤后21-28d进行Morris水迷宫试验。4周后处死并行全脑冷冻切片苏木精-伊红染色及荧光显微镜观察CM-Dil标记的脐带间充质干细胞的存活和分布情况,采用RT-PCR检测各组损伤区脑组织RhoA基因的表达量。结果与结论:移植后1,2,3,4周,大鼠神经学缺损评分脐带间充质干细胞移植组低于对照组(P<0.05),联合组明显低于对照组(P<0.01)。Morris水迷宫试验各组平均逃避潜伏期均逐渐缩短,联合组3-5d时平均潜伏时间较脐带间充质干细胞移植组缩短(P<0.05),较对照组明显缩短(P<0.01);联合组穿越平台次数及在目标象限游泳距离与总距离百分比均高于对照组和脐带间充质干细胞移植组(P<0.05)。移植4周后,脑组织冰冻切片和苏木精-伊红染色切片中的神经元数量和CM-Dil阳性细胞数联合组多于脐带间充质干细胞移植组,脐带间充质干细胞移植组多于对照组(P<0.05);联合组RhoAmRNA表达水平较对照组和脐带间充质干细胞移植组显著降低(P<0.05)。提示脐带间充质干细胞移植可明显改善重型颅脑损伤后大鼠的神经学功能,联合应用RhoA基因沉默有协同效果。

磁性荧光双标人骨髓间充质干细胞归巢至大鼠急性损伤肝组织示踪显像

目的观察磁粒子和荧光染料双标人骨髓间充质干细胞归巢至大鼠急性损伤肝组织的示踪。方法以超顺磁性氧化铁(SPIO)和氯甲基苯甲酰氨(CM-Dil)标记永生化人骨髓间充质干细胞(UE7T-13)。普鲁士蓝染色检测细胞内铁,荧光显微镜和流式细胞仪检测CM-Dil标记阳性率。建立12只急性肝损伤大鼠模型,分为实验组(n=6)和对照组(n=6),将标记细胞经尾静脉移植入实验组大鼠,未标记细胞移植入对照组大鼠。分别于移植前3h、移植后3h、3天、5天、7天应用MR T2*W、T2*map对大鼠活体成像,获得肝脏R2*值。并与肝脏组织切片普鲁士蓝染色和CM-Dil荧光表达情况对照。结果双标细胞的SPIO-PLL标记率接近100%,流式细胞仪检测CM-Dil标记阳性率达99.97%。实验组细胞移植后3天、5天肝脏R2*值均较移植前明显升高(t=7.282、7.608,P均<0.01),对照组细胞移植后各时间点与移植前比较,R2*值差异均无统计学意义(F=0.99,P>0.05)。普鲁士蓝阳性细胞主要分布于肝小叶中央静脉周围病变区,荧光显微镜下观察红色荧光阳性细胞与普鲁士蓝阳性细胞分布基本一致。结论 SPIO和CM-Dil可有效标记人永生化骨髓间充质干细胞(UE7T-13),不影响细胞增殖能力,临床应用型1.5T MR可对磁粒子标记的UE7T-13进行肝归巢活体示踪,CM-Dil有助于证实存活干细胞的肝内定植。

脂肪干细胞移植治疗化疗导致的口腔黏膜炎的初步观察

目的探讨脂肪干细胞(ADSCs)移植治疗化疗导致的口腔黏膜炎的效果。方法将10只金黄地鼠随机分为2组,制备化疗性金黄地鼠口腔黏膜炎模型,实验组(M组)于金黄地鼠口腔颊囊溃疡周边局部多点注射被标记的ADSCs+PBS细胞混悬液;对照组(N组)于相同部位注射等体积PBS。每天观察记录金黄地鼠口腔黏膜情况,比较实验组和对照组颊囊粘膜愈合情况。分别于实验第9天、第14天处死实验动物,制备组织标本,行大体观察、HE染色、冰冻切片、荧光显微镜下观察。利用SAS软件对数据进行分析。结果大体观察及组织学染色显示M组黏膜愈合程度及质量明显优于N组;荧光显微镜观察显示移植一周后CM-Dil染色的ADSCs能在该部位定居且存活良好。结论脂肪干细胞移植对口腔黏膜溃疡具有一定的促愈作用,可以快速治疗化疗导致的口腔黏膜炎。

大鼠骨髓间充质干细胞的分离培养及荧光标记的实验研究

目的建立一种分离纯化,培养扩增、荧光标记骨髓间充质干细胞的方法,为利用MSCs进行疾病的细胞治疗提供实验基础。方法密度梯度离心,贴壁培养和消化时间控制相结合,分离纯化骨髓间充质干细胞,并用荧光活性杂料CM-Dil标记。结果分离获得了高纯度贴壁生长的MSCs。MSCs原代培养呈均匀分布的集落样生长,呈梭形,细胞传代稳定,在体外连续传代培养9代,未发生形态学改变,无衰老征象;CM-Dil标记后,荧光显微镜下观察,见全部细胞标记后呈红色荧光,DIL标记阳性率为100%,标记的骨髓MSCs呈梭形,保持了良好的形。结论采用淋巴细胞分离液密度梯度离心,贴壁培养和消化时间控制相结合,以获得纯度较高和活性骨髓MSC,是简便有效使用可行的方法;CM-Dil是一种简洁、有效的标记骨髓MSCs的方法。

牙龈间充质干细胞在大鼠体内分布情况及其分离鉴定

目的了解一种新的牙龈来源的间充质干细胞(gingival tissue-derived mesenchymal stem cells,GMSCs)在大鼠体内的分布情况及其分离鉴定。方法取成人健康牙龈组织,经dispaseⅡ和胶原酶Ⅳ消化分离单细胞,培养并鉴定为MSCs。将36只SD大鼠(雌雄各半)分成两组:GMSCs移植组(n=24)和对照组(n=12)。GMSCs经尾静脉输入,并分别于移植后1、5、10、20和30天各时间点随机处死4只大鼠,快速取出心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、脑、胸骨、肌肉、睾丸或卵巢等组织,冷冻切片后荧光显微镜观察GMSCs生物分布。结果 GMSCs贴壁生长,呈长梭形,具有向脂肪细胞及成骨细胞分化的能力,CD29、CD39、CD73、CD90、CD105阳性率>95%,CD34、CD45、HLA-DR阳性率<5%。荧光显微镜观察结果显示,移植后1天肺CM-Dil阳性细胞数最高,其次为肝、淋巴结、胸腺、脾、肾、骨髓、外周血、卵巢。移植后肺、肝CM-Dil阳性细胞数缓慢下降;移植后10天淋巴结和胸腺CM-Dil阳性细胞数下降明显,但以后保持稳定。GMSCs移植大鼠后1~30天,在心、脑、睾丸、附睾、子宫、肌肉、皮肤等均未见有CM-Dil阳性细胞。结论 GMSCs移植大鼠后,在肺、肝、肾及免疫器官淋巴结、脾、胸腺分布较多,GMSCs移植后具有其特殊的生物分布特征,对将来指导GMSCs用于免疫治疗具有重要意义。