苦参碱改构体X调控Caspase-3,Caspase-8和Caspase-9蛋白表达诱导人鼻咽癌CNE1凋亡的研究

目的研究苦参碱改构体X体外诱导人鼻咽癌CNE1细胞凋亡的机制。方法用不同剂量改构体X处理CNE1细胞48h,透射电镜观察CNE1细胞超微结构变化;Westernblot检测改构体X对CNE1细胞内Caspase-3,-8,-9蛋白表达的影响。结果苦参碱改构体X作用CNE1 48 h后,细胞出现皱缩,核内异染色质明显增多,核周隙增大,凋亡小体形成等细胞凋亡特征形态,高剂量组较低剂量组细胞凋亡程度更加明显;Western blot检测显示,与阴性对照组相比,除低剂量改构体X对Caspase-8无上调作用外,其他剂量组可上调凋亡相关蛋白Caspase-3,-8,-9的表达(P<0.01),且具有剂量依赖性。结论苦参碱改构体X可通过上调促凋亡蛋白Caspase-3,-8,-9的表达诱导CNE1细胞凋亡。

低渗诱导高分化鼻咽癌细胞CNE-1容积激活性氯电流

目的:研究细胞外低渗诱导的高分化鼻咽癌细胞CNE-1的容积激活性氯电流。方法:全细胞膜片钳记录氯电流,通过应用氯通道阻断剂、离子置换和改变细胞容积方法研究该电流的特性。结果:当细胞在等渗环境中背景电流微弱且稳定,细胞外给予47%低渗刺激后电流迅速增大,呈外向优势,对阴离子通透性的大小为:I->Br->Cl->葡萄糖酸。氯通道阻断剂ATP和NPPB可逆性地抑制此电流,ATP的抑制作用在外向电流显著强于内向电流。此电流对细胞容积改变敏感,细胞肿胀时被激活,细胞发生皱缩时则被抑制。结论:细胞外低渗诱导CNE-1细胞产生氯电流,此电流对细胞容积的改变敏感,在CNE-1细胞容积调节中起重要作用。

PPAR-γ对人鼻咽癌CNE1/DDP细胞顺铂耐药性的逆转作用及其机制探讨

目的观察氧化物酶体增殖物激活受体-γ(PPAR-γ)对人鼻咽癌CNE1/DDP细胞顺铂耐药性的逆转作用,并探讨其机制。方法将CNE1/DDP细胞分别加入10、20μg/mL PPAR-γ激动剂罗格列酮和等体积培养液进行培养。采用MTS法检测细胞耐药逆转率,流式细胞术检测细胞凋亡率和P-糖蛋白(P-gp)表达,RT-PCR法和Western blot法检测多重耐药基因(MDR1)、多药耐药相关蛋白基因(MRP)和B淋巴细胞瘤-2基因(bcl-2)mRNA和蛋白表达,Western blot法检测磷酸化Akt蛋白(p-Akt)。结果加入等体积培养液和10、20μg/mL罗格列酮的CNE1/DDP细胞耐药逆转率分别为100.0%、149.3%±11.3%、293.8%±25.5%,其细胞凋亡率依次升高,PPAR-γ、MDR1、MRP、bcl-2 mRNA和蛋白表达以及p-gp阳性率、p-Akt表达依次降低;两两比较,P均<0.05。结论 PPAR-γ对CNE1/DDP细胞的顺铂耐药性具有逆转作用,且呈剂量依赖性;可能与其抑制Akt磷酸化和耐药基因MDR1、MRP表达,并促进细胞凋亡有关。

miRNA-325-3p通过下调细胞角蛋白13的表达降低鼻咽癌细胞CNE1的放疗敏感性

目的:探究miRNA-325-3p及其靶基因细胞角蛋白13(cytokeratin 13,CK13)对鼻咽癌细胞CNE1的放疗敏感性的影响。方法:通过miRBase、Targetscan及Microcosm三大数据库预测miRNA-325-3p的潜在靶基因,并通过双荧光素酶活性检测实验进行验证,qPCR检测不同放射剂量下鼻咽癌细胞CNE1中miRNA-325-3p及其靶基因的表达水平变化,通过克隆形成实验观察不同放射剂量下过表达miRNA-325-3p及敲低靶基因后CNE1细胞克隆形成率的变化,流式细胞术验证过表达miRNA-325-3p及敲低靶基因后CNE1在不同放射剂量下凋亡水平的变化,MTT法检测miRNA-325-3p过表达和CK13敲低组鼻咽癌细胞CNE1在不同放射剂量下的细胞存活率以验证其放疗敏感性的变化。结果:CK13确认为miRNA-325-3p的潜在靶基因,鼻咽癌细胞CNE1经放射处理后,miRNA-325-3p的表达水平显著升高、CK13的表达水平显著降低(均P<0.05)。miRNA-325-3p表达量上调和CK13基因沉默均显著提高CNE1细胞的存活率[miRNA上调时(:60.14±3.55)%vs(19.23±3.42)%,t=14.37、P<0.01;CK13沉默时:(76.15±5.13)%vs(28.53±3.68)%,t=13.06、P<0.01]和克隆形成率,降低了凋亡率[miRNA上调时:(27.95±2.67)%vs(51.68±3.47)%,t=9.39、P<0.01;CK13沉默时:(20.31±2.62)%vs(38.14±3.83)%,t=6.66、P<0.01]。结论:miRNA-325-3p能够通过下调靶基因CK13的表达降低鼻咽癌细胞CNE1对放疗的敏感性。

miR-17-5p通过下调BRMS1L表达调控鼻咽癌CNE2细胞增殖、侵袭、迁移和凋亡

目的:探讨miR-17-5p通过调控乳腺癌转移抑制基因1相似基因(breast cancer metastasis suppressor 1 like,BRMS1-like或BRMS1L)表达调控鼻咽癌细胞增殖和侵袭的分子机制。方法:收集2014年1月至2017年12月间平煤神马医疗集团总医院收治的40例鼻咽癌患者切除的鼻咽癌组织及其相应的癌旁组织标本,以及鼻咽癌细胞系CNE 2、HONE 1、C666-1和鼻咽部永生化上皮细胞株NP69,采用qPCR检测miR-17-5p在癌组织和癌细胞系中的表达水平。通过StarBase数据库预测BRMS1L与miR-17-5p的靶向关系,采用双荧光素酶报告基因实验进行验证。WB检测转染miR-17-5p模拟物和抑制物对CNE2细胞中BRMS1L表达的影响;CCK-8、Transwell和流式细胞术检测miR-17-5p/BRMS1L分子轴对CNE2细胞增殖、侵袭、迁移和凋亡的影响。结果:miR-17-5p在鼻咽癌组织和鼻咽癌细胞系中呈高表达(P<0.05或P<0.01),下调miR-17-5p显著抑制CNE2细胞增殖、侵袭、迁移但促进细胞凋亡(P<0.05或P<0.01)。miR-17-5p靶向作用于BRMS1L并下调其表达水平。过表达BRMS1L可显著抑制CNE2细胞增殖、侵袭、迁移而促进细胞凋亡(均P<0.01);而同时过表达miR-17-5p和BRMS1L可逆转上述作用(均P<0.01)。结论:miR-17-5p通过靶向下调BRMS1L的表达,进而促进CNE2细胞增殖、侵袭和迁移而抑制细胞凋亡。

5-氨基乙酰丙酸光动力对两株人鼻咽癌细胞杀伤效应的对比研究

目的探讨5-氨基乙酰丙酸(5-aminolevulinic acid,5-ALA)光动力学效应(photodynamic thera-py,PDT)对体外培养人鼻咽癌细胞株CNE2和C666-1的生物学作用。方法对体外培养的CNE2和C666-1分别加入不同浓度的5-ALA(0.01,0.05,0.1,0.25,0.5,1.0,2.0,4.0 mmol/L)孵育4 h,予波长为630 nm的半导体激光进行照射,照射的功率密度为20 mW/cm2,照射能量密度分别为2,5,10,20 J/cm2,继续孵育24 h,用四唑盐(MTT)比色法测定细胞存活率。结果5-ALA-PDT能有效地杀伤体外培养的人鼻咽癌CNE2和C666-1细胞,其杀伤作用大小与5-ALA的浓度和激光剂量呈正相关(P<0.01)。激光能量为20 J/cm2,5-ALA的浓度为2.5 mmol/L或2.0 mmol/L时,其杀伤CNE2,C666-1细胞的作用最明显;5-ALA-PDT对CNE2和C666-1的半数杀伤度(IC50)分别为0.14,0.32 mmol/L,两者间差异有显著性(P<0.05)。相同5-ALA浓度、激光剂量条件下,C666-1细胞存活率显著高于CNE2(P<0.05)。结论5-ALA-PDT对CNE2和C666-1细胞均有杀伤作用,但C666-1细胞对5-ALA-PDT的敏感性低于CNE2。

高剂量X射线对人鼻咽鳞癌CNE1细胞株HIF-1α表达影响的研究

目的:探讨高剂量X射线照射前后低氧诱导因子-1α(HIF-1α)在人鼻咽鳞癌CNE1细胞株中的表达情况。方法:体外培养人鼻咽鳞癌CNE1细胞株,待细胞进入对数生长期后行6MV X射线照射,照射方法为2Gy/次,隔日1次,共25次,累积剂量50Gy,收集照射前后细胞采用免疫荧光染色、RT-PCR和蛋白质印迹法检测高剂量X线照射前后CNE1细胞株中HIF-1α基因及其蛋白的表达。结果:照射前后HIF-1α基因的表达的半定量值分别为0.23±0.02和0.37±0.04,t=-5.422,P=0.006;其蛋白的表达的半定量值分别为0.05±0.01和0.08±0.01,t=-3.674,P=0.021;X线照射50Gy后HIF-1α在CNE1细胞中的表达比照前明显增高,P<0.05;共聚焦显微镜观察到X线照射50Gy后的CNE1细胞中绿色荧光强度高于照射前。结论:X射线照射可以引起HIF-1α在CNE1细胞中表达升高。

顺铂增加BCL-2蛋白高表达的鼻咽癌细胞凋亡

目的:通过对3种不同鼻咽癌细胞的BCL-2蛋白表达、细胞存活率和凋亡率的观察,探讨提高顺铂治疗鼻咽癌疗效的新方法。方法:采用Western blot技术检测3种不同鼻咽癌细胞CNE1、C666-1及SUNE1的BCL-2蛋白的表达情况;采用MTT法及流式细胞技术,检测并比较顺铂对3种鼻咽癌细胞的细胞存活率和凋亡率的影响。结果:BCL-2蛋白在CNE1及C666-1细胞上高表达,在SUNE1上几乎无表达(P<0.05);经顺铂干预后,CNE1及C666-1细胞的细胞凋亡率明显升高,存活率明显低于对照组(P<0.05);SUNE1细胞的细胞凋亡作用较弱(P<0.05)。结论:BCL-2蛋白在不同类型的鼻咽癌细胞上表达量不同,提示顺铂对BCL-2蛋白高表达的鼻咽癌细胞的杀伤作用更强。